Sentetik COVID aşılarında neler var? Her bir malzemeyi inceliyoruz…

 Gönderi tarihi Eylül 2, 2021 Hikmet Geçkil tarafından

Pfizer-BioNTech

İçeriği:

• BNT162b2 [mRNA]
• ((4-hidroksibütil)azanedil)bis(heksan-6,1-diil)bis(2-heksildekanoat) (ALC-0315)
• 2-[(polietilen gikol)-2000]-N,N-ditetradeasetilamid (ALC-0159)
• distearoilfosfatidilkolin (DSPC)
• kollesterol (bir nevi yağ ve hormon öncülü)
• potasyum klorür (bir nevi tuz)
• monobazik potasyum fosfat (enerji, fosforilasyon molekülü ve tampon)
• sodyum klorür (bildiğimiz tuz)
• dibazik sodyum fosfat .2H2O (enerji, fosforilasyon molekülü ve tampon)
• sükroz (çay şekeri)
• enjekte etmek için hepsi su

Aktif içeriği

• mesajcı ribonükleik asit – BNT162b2 [mRNA]

Bu mRNA, vücudun koronavirüs spike proteinleri yapmak için kullandığı ve bizi gerçek koronavirüse karşı koruması gereken bir bağışıklık tepkisini tetikleyen ünlü mRNA veya haberci (mesajcı) RNA’dır. İlginç bir şekilde, Pfizer’in mRNA’sı, doğal olarak oluşan mRNA’dan biraz farklıdır (urasil (U) nükleosidleri ile modifiye edilmiştir ve herbirinin yerine psödo(sahte) urasil yerleştirilmiştir. Bu hile, 15 yıldan daha uzun bir süre önce keşfedilen bir numaradır. Neye yarar? Bağışıklık sistemimizin yabancı mRNA’yı Spike proteinlerini yapmak için kullanılmadan önce tanımasını ve yok etmesini engeller.

Lipid nanopartikül kaplaması

• ((4-hidroksibütil)azanedil)bis(heksan-6,1-diil)bis(2-heksildekanoat) (ALC-0315)
• 2-[(polietilen gikol)-2000]-N,N-ditetradeasetilamid (ALC-0159)
• distearoilfosfatidilkolin (DSPC)
• kollesterol

Spike proteinleri yapmak için mRNA’nın hücrelerimizin içine girmesi gerekir ve hücrelerimizde mRNA gibi molekülleri iten yağlı zarlar bulunur. Bu nedenle aşı, mRNA’yı kaplayan dört farklı lipidle (hücre zarlarına daha çok benzeyen uzun, yağlı moleküller) sahiptir. Nanometre boyutunda baloncuklar oluştururlar ve bu nedenle ‘lipid nanopartiküller‘ olarak bilinirler.

Pfizer’in lipid kombinasyonu, son on yıldır terapötikler (ilaçlar) için farklı lipid kombinasyonlarını araştıran Acuitas adlı bir şirket tarafından geliştirilmiştir. Dört farklı lipidin bu kombinasyonu, Pfizer ve Acuitas tarafından mRNA’nın hücrelere alınmasında en etkili olarak değerlendirildi.

Lipidlerin üçü (ALC-0315, ALC-0159 ve DSPC) sentetik olarak tasarlanmıştır ve daha önce birkaç terapötik tedavide kullanılmıştır, dördüncüsü (kolesterol) ise vücudumuzun halihazırda birkaç gram içerdiği bir moleküldür.

Tamponlar (asit-baz dengeleyicileri)

• potasyum klorür
• monobazik potasyum fosfat
• sodyum klorür
• dibazik sodyum fosfat .2H2O

Aşıdaki mRNA (aslında bunlar vücudumuzdaki proteinleri de kodlayan molekül çeşitleridir) – asitliğe veya pH’a oldukça duyarlıdır. Tuzlar, pH tamponları olarak hareket edebildikleri ve bir çözeltinin fazla asidik veya bazik hale gelmesini önledikleri için eklenir. Pfizer aşısındaki dört tuz, pH’ı zaman içinde kararlı tutmak için tasarlanmıştır. Tuzlardan ikisi (monobazik potasyum fosfat ve dibazik sodyum fosfat dihidrat) ayrıca bazı farmasötik tedavilerde, gübre ve gıda katkı maddeleri olarak kullanılırken, potasyum klorür ve sodyum klorür (sofra tuzu) yaygın, doğal olarak oluşan maddelerdir.

Kararlaştırıcı şeker

sükroz (çay şekeri)

Özellikle düşük sıcaklıklarda depolandığından, diğer bileşenleri kararlı tutmak için aşıya sükroz (çay şekeri) eklenmiştir.

Çözücü

su

Son olarak, bu bileşenlerin hepsinin sıvı halde olması gerekir, bu nedenle bir aşının bunları eritecek ve karıştıracak bir şeye ihtiyacı vardır. Neyse ki su, bunu yapmak için mükemmel moleküldür, bu yüzden aşıya eklenen son maddedir.

Moderna

İçeriği:

• mesajcı ribonükleik asit (mRNA)
• SM-102
• polietilen glikol [PEG] 2000 dimyristoylgliserol [DMG]
• kollesterol
• distearoilfosfatidilkolin (DSPC)
• trometamin (diğer adı ile Tris tamponu)
• tromeamin hidroklorid
• asetik asit
• sodyum acetate. 4 sulu
• sükroz
• su

Aktif içeriği

• mesajcı ribonükleik asit [mRNA-1273]

Pfizer aşısında olduğu gibi, Moderna aşısı da bağışıklık sistemini mRNA ile hazırliyor. Moderna’nın mRNA’sı da doğal olarak oluşan mRNA’dan (nükleozid modifiyeli) biraz farklıdır, bu nedenle bağışıklık sistemini yanlış noktada tetiklemez.

Lipid nanopartikül kaplaması

• SM-102
• polietilen glikol [PEG] 2000 dimyristoylgliserol [DMG]
• distearoilfosfatidilkolin (DSPC)
• kollesterol

Pfizer aşısı gibi, Moderna aşısındaki mRNA’nın da hücrelere girmesine izin vermek için yağlı bir kaplamaya ihtiyacı vardır ve bir kez daha lipidler anahtar rol oynar.

Kullanılan lipidlerden ikisi (DPSC ve kolesterol) Pfizer aşısındakilerle aynıdır. (Moderna’nın belgelerinde, DSPC, distearoilfosfatidilkolin yerine 1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfokolin olarak anılır, ancak aynı moleküldür, farklı, eşit derecede telaffuz edilemez bir ada sahiptir.)

Diğer iki lipid sentetik olarak tasarlanmıştır. Lipid nanoparçacık kombinasyonu yıllardır geliştiriliyor ve test ediliyor olsa da, Moderna şu anda daha küçük bir şirket olan Arbutus ile belirli lipit kombinasyonları üzerindeki patentler konusunda yasal bir savaşta. Arbutus, Moderna’nın aşı (veya diğer ürünler) üzerinden elde ettiği herhangi bir kârdan telif ücreti alıp alamayacağı belirsiz. Bu yüzden onları kimin tam olarak geliştirdiği belli değil, ancak en azından iki şirket onlara çok fazla zaman ve fon harcadı.

Tamponlar (asit-baz dengeleyicileri)

• trometamin
• tromeamin hidroklorür
• asetik asit (zayıf bir asit)
• sodyum asetat. 3 sulu

Diğer aşılarda olduğu gibi, pH’ı korumak için tamponlar kullanılır.

Trometamin ve trometamin hidroklorür kimyasal araştırmalarda çok yaygın tamponlar olsa da, muhtemelen sirkenin bir en aşina olduğunuz zayıf bir asit olan sirke asidi (asetik asit)tir. Sodyum asetat trihidrat (asetik aside çok benzer) yaygın bir gıda katkı maddesidir.

Diğer maddlere

• sükroz
• su

Diğer aşılarda olduğu gibi, bileşenleri kararlı yapmak için ve karıştırmak için şeker ve su eklenir.

Oxford-AstraZeneca

İçeriği:

• 5 x 1010 ChAdOx1-S (rekombinant) viral partiküller (açıklama: Spike taşıyan, doz başına 50 milyar adet şempanze adenovirüsü. Adenovirüsler: çift ​​sarmallı bir DNA genomu içeren bir ikosahedral (20 yüzlü) nükleokapsidi olan zarfsız virüsler.İlk defa insan adenoidlerinden (lenf bezleri) izole edildikleri için bu ad verilmiştir)
• L-histidin (amino asit)
• L-histidin hidroklorür monohidrat (1 sulu)
• magnezyum klorür heeksahidrat (6 sulu)
• polisorbat 80
• etanol
• sükroz
• sodyum klorür
• disodyum asetat dehidrat (2 sdulu)
• enjeksiyon için su

Aktif içeriği

• 5 x 1010 ChAdOx1-S (rekombinant) viral partiküller

Oxford-AstraZeneca aşısını ‘viral vektör’ aşı yapan ‘viral vektör’ budur. Bağışıklık sisteminizi tetikleyecek olan SARS-CoV-2 spike proteinlerini yapmak için DNA içeren nispeten uslu bir virüstür (bir adenovirüs, bir koronavirüs değil!).

Adenovirüs, çoğalamayacak veya insanlara zarar vermeyecek şekilde değiştirilmiştir. Aslen bir şempanzede bulunan bir adenovirüs üzerinde modellenmiştir, ancak bu aşının üretiminde hiçbir şempanze yer kullanılmaz. Bunun yerine, orijinal olarak bir insan böbreğinden alınan ve daha sonra genetiği değiştirilmiş hücrelerden büyütülen laboratuvar temelli hücrelerde çoğaltılır.

AstraZeneca’nın etken maddesi, adenovirüs formunda kendi kaplama paketiyle birlikte geldiğinden, Pfizer aşısı gibi lipidlere ihtiyaç duymaz. Bununla birlikte, pH’ı tamponlamak ve sabit tutmak için moleküllere ve ayrıca birkaç koruyucuya ihtiyaç vardır.

Tamponlar (asit-baz dengeleyicileri)

• L-histidin (bir amino asit çeşidi)
• L-histidin hidroklorür monohidrat
• magnezyum klorür kekzahidrat
• sodyum klorür

Pfizer aşısı gibi, pH’ı kararlı bir şekilde tutmak için tuzlar (magnezyum klorür heksahidrat ve sodyum klorür) ve aminler (L-histidin ve L-histidin hidroklorür monohidrat) eklenir.

Her iki tuz da doğal olarak oluşan minerallerdir, L-histidin ise amino asit olarak bilinen bir moleküldür. Bu bileşikler, proteinlerimizin yapıldığı şeydir, bu yüzden içinizde zaten bol miktarda L-histidin var. L-histidin hidroklorür monohidrat, histidine benzer (dolayısıyla adı) ve ayrıca gıdalarda, kozmetiklerde ve sabunlarda kullanılır.

Emulsifiye (kıvam verici) madde

• polisorbat 80 (gıda ve kozmetikte sıklıkla kullanılan iyonik olmayan bir yüzey aktif madde ve emülgatör)

Yağlı maddeler (adenovirüslerin dış kısımları gibi) ve sulu şeyler birbirine iyi karışmaz, bu nedenle AstraZeneca aşısı bunları birleştirmek için bir emülgatör gerektirir. Bir emülgatör, hem hidrofobik (yağlı) hem de hidrofilik (sulu) bölümlere sahip olan ve bunların karışmasını sağlayan bir moleküldür (deterjanlar ve sabunlar yaygın bir örnektir; yumurta sarısındaki lesitin bir başka örnektir).

Polisorbat 80, emülsifiye edici özelliklerinden dolayı yaygın bir gıda katkı maddesidir ve aynı zamanda diğer, COVID olmayan aşılarda da kullanılmıştır.

Prezarvatifler (koruyucular)

• ethanol (alkol)
• Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)

AstraZeneca aşısı çok steril koşullarda muhafaza edilmesine rağmen, flakonlardan veya üretim sürecinden kaynaklanan her türlü kontaminasyonu önlemek için koruyucular kullanır. (Pfizer koruyuculardan kaçınmayı tercih etti, bu da aşının daha az içerik gerektirdiği anlamına gelir, ancak kontamine olmadıkları garanti edilemediğinden bazı dozlar atılmıştır.)

Koruyucu olmasının yanı sıra, etilendiamintetraasetik asit (EDTA), bazı metal zehirlenmelerinin tedavisi için onaylanmış bir ilaçtır. Etanol, el dezenfektanı, bira ve şarapta elde ettiğiniz alkolle aynıdır, ancak 0.5 milimetrelik bir dozda %0.005’ten daha düşük bir konsantrasyonda kandaki alkol içeriğinizi etkilemez.

Diğer içerikler

• sükroz
• su

Pfizer aşısında olduğu gibi, bileşenleri kararlı kılmak için şeker ve tüm bileşenleri birleştirmek için su kullanılır.

Kaynak: Cosmos Dergisi (Avusturalya)

Pfizer/BioNTech: Covid-19 Aşısını Nasıl Yapıyor?

Moderna ve Pfizer/BioNTech mRNA Aşıları Nasıl Çalışıyor?

Özlem Türeci & Uğur Şahin’e “Hassas Tıp İlham Ödülü”

 Gönderi tarihi Ağustos 15, 2021 Hikmet Geçkil tarafından

Pfizer/BioNTech COVID-19 mRNA aşısının nasıl yapıldığını burada, nasıl çalıştığını ise burada daha önce vermiştik…

PMWC 23-24 Eylül 2021, Pittsburgh konferansında, PMWC Luminary Ödülü, kişiselleştirilmiş tıbbı kliniğe hızlandıran önde gelen isimlerin son katkılarını takdir eder. PMWC 2021 Pittsburgh Armatür (Aydınlatıcı) Ödülü, dünya çapında sayısız hayat kurtaran COVID-19’a karşı önde gelen aşılardan birinin geliştirilmesine yönelik çalışmaları nedeniyle Dr. Özlem Türeci ve Dr. Uğur Şahin‘e verilecek. Ayrıca Florida Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Dekanı Julie Johnson, farmakogenomik keşif araştırmaları ve klinik uygulamasında erken lider olarak onurlandırılacaktır.

Geçtiğimiz on sekiz ay boyunca, bu karı koca ekibinin yaşam boyu çalışmaları, pandemi nedeniyle küresel ilgi odağı haline geldi; şimdi dünya nüfusunun çoğunu koruyan şey, onların COVID-19’a karşı güçlü mRNA aşıları.

“Bizim için mesele insanları korumak ve hayat kurtarmaktı. SARS-CoV-2’nin nasıl yayıldığını anladık ve önceki 10 yılda ilerleme kaydettiğimiz mRNA teknolojisini, COVID-19 aşısını bu kadar hızlı ve etkili bir şekilde geliştirmek için uyarlayabildik. ” diyor Dr. Uğur Şahin

Bu hikaye yirmi yılı aşkın bir süre önce Uğur Şahin’in Almanya’nın Köln şehrinde okurken Özlem Türeci ile tanışmasıyla başlar. İkisi de Türk asıllı olan Dr. Şahin ve Dr. Türeci, ilk şirketleri Ganymed İlaç’ı 2016 yılında 1.4 milyar dolara Astellas’a sattı. Ancak, dünya üzerinde daha da büyük bir etki yaratacak olan ikinci şirketleri idi. Ganymed gibi, Dr. Şahin ve Dr. Türeci de 2008 yılında BioNTech’i kanseri tedavi etmek amacıyla başlattılar, ancak BioNTech’i özellikle bilimin en ileri noktasında daha geniş bir teknoloji yelpazesini keşfetmek için yarattılar. Yüz milyonlarca dolar fon topladıktan ve 1.800’den fazla personele ulaştıktan sonra BioNTech, 2018’de Almanya ve Amerika Birleşik Devletleri’nde ofisleri bulunan grip için geliştirilmiş bir aşı geliştirme hedefiyle Pfizer ile ortaklık kurdu.

Ancak, 2020 yılının Mart ayında değişti. Dünya küresel bir salgınla karşı karşıya kaldı, karı koca ikilisi çabalarını koronavirüse karşı bir aşı geliştirmeye kaydırdı. Buna paralel olarak, 10 yaşındaki biyoteknoloji Moderna, COVID-19’a karşı etkili bir aşı oluşturmak için aynı sentetik mRNA teknolojisini kullanıyordu ve Aralık 2020’de Pfizer/BioNTech (BNT162b1) ve Moderna (mRNA-1273) aşılarına bir hafta ara ile FDA tarafından acil kullanım izni verildi.

Warpspeed Operasyonunun başlangıcında oluşturulan yaklaşık üç düzine aşı adayı arasında bunlar, alanın geri kalanından çok daha yüksek verimlilikleri olan bitiş çizgisini geçen ilk ikisiydi ve Pfizer’in üretim gücü üretimi artırdı. BioNTech haberci RNA aşısı, dünya tarihinde bir halk sağlığı krizine herhangi bir yanıtın açık ara en hızlı gelişimi ve yaygınlaştırılmasıydı ve tarih yazılmıştı.

SARS-CoV-2’nin Ötesinde mRNA Teknolojisinin Potansiyeli

2014’te Şahin, Türeci ve Kariko Nature’da yeni bir ilaç sınıfı olarak mRNA’nın potansiyelini gözden geçirerek “Sentetik mRNA, yapısal olarak doğal mRNA’ya benzeyerek proteinleri geçici olarak ifade etmek için tasarlanabilir” başlıklı bir makalede “… Bu ilaç sınıfının, özellikle IVT mRNA’nın (In Vitro-Transkripsiyonlu mRNA Terapötikleri) translasyonel etkinliğinin ve immünojenisitesinin kontrol edilmesiyle ilgili doğal zorlukları, geniş bir potansiyel uygulama yelpazesi için temel sağlar.” diye özetlediler.

Bu incelemeden bu yana, mRNA tabanlı kanser immünoterapileri ve bulaşıcı hastalık aşıları klinik gelişime girmiştir. Başarılı BioNTech aşısı sonucunda mRNA bazlı terapötiklere, özellikle kansere karşı mRNA bazlı aşılara olan ilgi katlanarak artmış ve konu bilimsel tartışmaların ön sıralarına taşınmıştır. Dr. Türeci ve Dr. Şahin’e göre, BioNTech COVID-19 aşısının başarısından öğrenilen ve tümü COVID-19’un ötesindeki hastalıkları tedavi etmek için genişletilebilecek birkaç büyük ders var:

• iyi tolere edilen bir dozda verilen bir mRNA aşısı, nötralize edici antikor yanıtlarını ve güçlü CD8+ ve CD4+ T hücre yanıtlarını indükleyebilir;
• mRNA aşıları, hastalığa karşı korumayı artırma, bir hastalığın şiddetini azaltma, iyileştirilmiş bir sonuç verme, böylece enfeksiyon oranlarını ve hastaneye yatış sıklıklarını azaltma yeteneğine sahiptir;
• bir mRNA aşısı, sadece virüse karşı değil, aynı zamanda ortaya çıkan varyantlarına karşı da etkinlikte önemli bir azalma olmaksızın güçlü bir bağışıklık tepkisi indükleyebilir;
• mRNA aşıları, yalnızca geliştirme ve üretim için gereken kısa süre değil, aynı zamanda tekrar uygulamadan sonra gösterildiği gibi olumlu bir tolere edilebilirlik profili göz önüne alındığında, destekleyici uygulama için iyi konumlandırılmıştır.

“Koronavirüs aşısıyla geliştirmenin tüm aşamalarından geçtik, ancak kanser aşılarıyla henüz bu ölçütlere ulaşamadık. Artık bu dersleri ve uzmanlığı kanser projelerine taşıyabiliriz. Elbette daha fazlasına ihtiyacımız var. Her bir ek ilaç için veri ve sadece bir şeyleri tahmin edemezsiniz, ancak dünyadaki düzenleyiciler mRNA’nın nasıl çalıştığını, güvenlik ve tolere edilebilirlik profilinin ne olduğunu ve üretimin kalite testinin nasıl görünebileceğini çok net bir şekilde gördüler. Onlara önemli bilgiler sunduk, ancak gerçek kanser aşılarının geliştirilmesinde henüz o kadar ileri gitmedik.” diyor Dr. Özlem Türeci.

Kanser Aşılarının Süper Gücü, Erken Evre Hastalığı Olan Hastalara En İyi Yardımcı Olabilir

Dr. Özlem Türeci “Vizyonumuz bağışıklık sistemini kanserle savaşmak için kullanabilmek. BioNTech ile yaptığımız da bu. Bir dizi bağışıklık tedavisi yaklaşımı geliştirdik ve mRNA dört taneden biri. Bunu, tümörlere farklı açılardan saldırmak için bir dizi yöntemin bir parçası olarak kullanıyoruz.” diyor.

İlginç bir şekilde, en yeni kanser aşılarından bazıları bağışıklık sistemini hastalar arasında paylaşılan “tümörle ilişkili antijenleri” tanıması için eğitirken, diğerleri her hastaya ve onun spesifik kanser oluşumuna özgü “neoantijenlere” odaklanır.

Eşsiz zorluklar devam etse de (örneğin, ortak, neoantijen olmayanlar yalnızca zayıf immünojeniktir ve bu nedenle tedavi için uygun moleküler hedefleri temsil etmezler), Dr. Şahin’in melanomla ilgili son denemelerinden biri, halihazırda önemli tedavi görmüş hastalarda şunu göstermiştir: kontrol noktası blokaj tedavisi, tümörle ilişkili bir antijen aşısının eklenmesi, hastaların büyük bir yüzdesinde önemli bir nesnel yanıtla sonuçlandı.

“BioNTech şu anda Faz II Denemelerinde belirli kanser türlerine karşı mRNA tabanlı tedavileri test ediyor. Bu çalışmaların başarılı olup olmamasına bağlı olarak, 2024’te yetkililere ilk sunum için bir paketimiz olabileceğini hayal ediyoruz.” diyor Dr. Uğur Şahin

Pfizer/BiNTech mRNA COVID aşısı

Moderna’nın mRNA COVID aşısı

Varyant nedir? Farklı varyant türleri nelerdir?

 Gönderi tarihi Ağustos 12, 2021 Hikmet Geçkil tarafından

Tüm RNA virüsleri gibi, SARS-CoV-2 de her replikasyon sırasında mutasyona uğrayabilir. Çoğu mutasyon fark edilmez, ancak bir mutasyon yeni bir türün ortaya çıkmasına neden olabilir. Buna varyant denir. Farklı türde varyantlar vardır: endişe verici varyant (VOC) , ilgilenilen varyant ve izlenen varyant.

• 

VOC, bulaşıcılığı artırabilen veya SARS-CoV-2 epidemiyolojisi üzerinde olumsuz bir etkiyle sonuçlanabilen bir değişikliği temsil eder. Ayrıca klinik olarak daha şiddeti olabilir, SARS-CoV-2 kontrol veya önleme tedbirlerini etkileyebilir veya bir tanı testini etkileyebilir. Endişe verici bir varyantla enfekte olmuş bir hasta daha uzun süre tecrit edilmelidir veya vakayı yönetmek için özel önlemler alınması gerekebilir.

İlgilenilen bir varyant (araştırma altındaki bir varyant olarak da bilinir) tipik olarak fenotipik farklılıklarla ilişkili bir mutasyona sahiptir, ancak aktarılabilirlikte (yayılımda) bir artışa sahip değildir. Bu tür bir mutasyon iletimden ve çoklu vakalardan sorumlu olabilir.

İzleme altındaki bir varyantın virolojik, epidemiyolojik veya klinik değişikliklerle ilgili hiçbir etkisi yoktur, ancak evrimini takip etmek ve virüsü daha iyi anlamak için bu tür varyantı izlemek önemlidir.

Varyantların yanı sıra, bir virüsün sınıflandırılmasının başka yolları da var mı?

Evet. Kladlar, soylar veya mutasyonlar belirtmek için moleküler sınıflandırmalar kullanılabilir. NEXSTRAIN yazılımı, kladları yılın numarasıyla (örneğin 19, 20), varış sırasına (örneğin A, B, C, D) ve ona verilmiş küresel salgın soyunun filogenetik adına göre yapılır. Örneğin, Birleşik Krallık varyantı için NEXSTRAIN ve GISAID, PANGOLIN’in 20I/501Y.v1’i veya B.1.1.7 olacaktır – bu aynı virüstür.

6 Mayıs’ta İngiltere Halk Sağlığı (PHE), hem Hindistan’daki hem de Birleşik Krallık’taki durum nedeniyle B.1.617.2’yi bir endişe türü (VOC) olarak sınıflandırdı. O zamanlar bu varyant Fransa’da hala izlenme altında olan bir varyant olarak kabul edildi.

Anahtar mutasyonlar ve bunların varyantlar arasındaki farkı?

D614G mutasyonu Mart 2020’de ortaya çıktı (ve Türkiye’de ilk olarak muhtemelen 10 veya 11 Mart 2020’de tek vaka olarak tesbit edildi). Bu mutasyon başlangıçta Wuhan’da yoktu ama şimdi hastalarımızda gördüğümüz tüm suşlarda mevcut. Bu mutasyon hastalarda viral yükü artırabilirken, klinik bir ek etki görülmemiştir.

Birleşik Krallık varyantında (B.1.1.7), çok önemli olan spesifik bir mutasyon vardır: N501Y. Bu suşun, daha yüksek viral yüklere sebep olduğu ve daha bulaşıcı olduğu tanımlanmıştır.

Güney Afrika varyantı (B.1.351) de Eylül 2020’de keşfedildi. Bu varyantta gözlemlenen mutasyonlar, Birleşik Krallık varyantı gibi N501Y’nin yanı sıra ACE2 reseptörlerine bağlanmayı etkileyebilecek 417N mutasyonunu içerir. Ayrıca, bu varyantta bulunan 484K mutasyonunun aşı etkinliği üzerinde olumsuz bir etkisi vardır.

Bu suş ayrıca Birleşik Krallık varyantından daha az olsa da bulaşıcılığı artırabilir ve daha yüksek bir viral yük sunabilir. Hastaneye yatış ve ölüm riskinin yanı sıra klinik şiddeti de artar. Bu mutasyonların varlığı, hem doğal bağışıklama hem de aşılama yoluyla bağışıklamaya karşı olası direnç sağlayan bir ortam yaratır.

Brezilya (P1) varyantı Ekim 2020’de keşfedildi. Bu varyantta gözlemlenen mutasyonlar, ACE2’ye bağlanmayı etkileyebilecek 501Y ve 417T’dir. Spike şekli üzerinde etkisi olabilecek 484K mutasyonu da mevcuttur. Bulaşıcılık, aşılara direnç, bulaşıcılık ve öldürücülük arttırılabilir ancak bu alanda çalışmalar devam etmektedir.

B.1.525 varyantı (Fransa’da yaygın) ve Kaliforniya soyu gibi diğer soylar dahil olmak üzere birçok başka varyant vardır. Şu anda endişe yaratan bir varyant, Hint soyundan gelen B.1.617 varyantıdır. Hindistan’da bulunan üç farklı varyant vardır ve bu Hint soyu iki spesifik mutasyona sahiptir: 452R ve/veya E484Q.

Bu varyantlardan biri (B.1.617.2) yüksek düzeyde iletilebilirliği nedeniyle PHE tarafından VOC olarak sınıflandırılmıştır. Hindistan’daki suşların çoğu bu varyanttandır.

Bu varyantların epidemiyoloji üzerindeki etkisi nedir?

Başlangıçta, SARS-CoV-2’nin 19A ve 19B suşları Wuhan’da ortaya çıktı ve diğer suşlar gelişti. Çoğunluk suşu her değiştiğinde, bir enfeksiyon dalgası vardır ve bunun tersi de geçerlidir.

Sorulması gereken soru, suşun bir dalgayı mı yoksa dalganın yeni bir suşu mu tetiklediğidir.

Bu soruyu yanıtlamak zor çünkü göz önünde bulundurulması gereken hassas bir denge vardır. Bir tarafta bariyer önlemleri, kontrol altına alma, geçerli testler ve temas takibi gibi faktörler var; diğer yandan, korunma önlemlerindeki azalmalar, sınırlamaların kaldırılması, bulaşıcılığın artması, test etme veya etkisiz takip ve sağlık sisteminn doygunluğa ermesi.

2020 yazında, bazı ülkelerde tatiller nedeniyle korunma tedbirlerinde bir düşüş ve ardından Ağustos ve Eylül aylarında vakalarda artış meydana geldi ve bu da sağlık sisteminin tamamen doymasına (nerede is çökmesine) neden oldu. Ancak Aralık 2020 ve Ocak 2021’deki daha yeni dalga farklıydı. Koruyucu önlemlerde herhangi bir azalma olmadı, ancak İngiltere varyantı (B.1.1.7) ortaya çıktı ve o kadar bulaşıcıydı ki, bu nedenle yeni bir dalga meydana geldi.

Dünya genelindeki durum, en çok etkilenen bölgeler: ABD, Güney Amerika, Avrupa ve Hindistan. Bu arada İsrail, Avustralya ve Japonya gibi ülkeler yüksek aşı oranları nedeniyle SARS-CoV-2’yi yönetmeye çalışıyor.

Varyantların test performansı üzerindeki etkisi nedir?

Spike genlerindeki mutasyon, sinyal tespiti açısından sorunlara yol açabilir. Örneğin Thermo Fisher TaqPath testi potansiyel olarak mutasyonlardan etkilenebilir, çünkü sinyallerden biri 69/70 kaybı (delesyon) ile aynı konumda bir bölgenin amplifikasyonundan sonra üretilir.

Bu delesyon, Birleşik Krallık varyantında mevcut olduğundan, sinyal güçlendirilemedi. Bu sorunlar, özellikle bir testin halihazırda dolaşan suşların varlığını tespit edemediği durumlarda yanlış negatif sonuçlara yol açabilir. Bir patolog veya virologun test sırasında tutarsızlıklar fark ederse, FDA’ya veya eşdeğer bir kuruluşa bir PCR sinyaliyle ilgili bir sorun olduğunu bildirmesi önemlidir. Bu sorunu tipik olarak üç teknik sahiptir: TaqPath, Accula ve Linea testi, ancak herhangi bir testte de ortaya çıkabilir.

Bu nedenle, birden fazla hedefi güçlendiren bir teknik kullanmak esastır. Bir test yalnızca bir hedefi çoğaltabiliyorsa (amplifikasyon), testin tanımadığı bir varyanta uygulanmasında yanlış negatif sonuç olasılığı vardır.

Varyant tarama testleri bu sorunun ele alınmasına nasıl yardımcı olabilir?

Bir varyant tarama tahlili, örneğin bir aşıya daha az etkinlik gösteren bir varyantın varlığını teyit eden hayati bilgiler sağlamanın yanı sıra, belirli bir varyantın varlığını teyit edebilen bir tahlildir.

Bazı mutasyonlar, uygulanması çok kolay olan ve bir multipleks tahlile benzeyen bir teknik olan PCR sinyali yoluyla da taranabilir. Bununla birlikte, bir tarama testinden daha az hassasiyet sunar, bu nedenle sonuçlar yorumlanırken bu dikkate alınmalıdır.

Kullanışlı bir başka test türü de TEM’e dayalıdır. Bu teknik, hibridizasyon sıcaklıklarını karşılaştırarak bir mutasyonu veya vahşi tip bir suşu tespit edebilir.

Varyantların ve mutasyonların etkileri, hücre reseptörü ile etkileşime giren reseptör bağlama alanında (RBD) ve N-terminali alanında neredeyse yalnızca spike protein açısındandır. RBD ve N-terminal alanı, virüs ve konakçı bağışıklığı arasındaki etkileşimde yer alan spike proteinin S1 kısmında mevcuttur.

Spike dizisi, tüm genom dizisinin 1/10’unu temsil eder. Yeni Nesil Dizileme (NGS) yoluyla SARS-CoV-2 genomunun tek koşmada 29.903 nükleotidini dizilemek mümkündür. Sanger dizileme, 1.000 nükleotide kadar parça içeren tek bir zinciri hedeflerken, S geni yaklaşık 3.821 nükleotittir. S geninin sadece bir koşmada sıralayabiliriz, ancak birkaç suş karıştırıldığında bir Sanger metodu kullanmak mümkün değildir.

Yeni Nesil Dizileme ile kısa parçaları çoğaltabilir ve dizileyebiliriz, ancak bu, tek tek dizilenen milyonlarca parçanın oluşturulmasını içerir. Bu yaklaşım daha pahalı, daha karmaşık ve teknik olarak daha zahmetlidir. Bu zorluklara rağmen, varyantları kladlar halinde sınıflandırmak ve RT-PCR’yi potansiyel olarak etkileyen mutasyonları aramak için tüm genomun dizilenmesi önemlidir.

Varyantların aşılama üzerindeki etkisi nedir?

Pfizer, Moderna ve Comirnaty gibi aşılar, mRNA kodlu başak proteinlerinden oluşur ve enfektiviteden yoksundur, bu da anti-S antikorlarının sentezine yol açar. Alt birim protein aşıları, geleneksel aşılar ve AstraZeneca, Janssen veya Sputnik V tarafından üretilen Vaxzevria gibi viral vektör aşıları, anti-S antikorlarının sentezini harekete geçiren gen kodlayan spike protein içeren replikasyon yapmayan bir viral vektörden oluşur.

Bir dizi aşı, D614G mutasyonu veya UK varyantı olan varyantları hala etkileyerek hastalığı ve enfeksiyonu önleyebilir. Bununla birlikte, Güney Afrika varyantı (B.1.351) veya Brezilya varyantı (P.1), aşıların daha az etkili olduğunu görstermektedir, örneğin, AstraZeneca aşısı, bu varyantlarla hastalıkları önlemede yalnızca %10 civarında etkinlik göstermektedir. New England Journal of Medicine ve The Lancet’te aşılı kişilerde enfeksiyon hakkında sunulan son araştırmalar, 16 Aralık 2020 – 9 Şubat 2021 tarihleri ​​arasında aşılanmış sağlık çalışanları arasında yeni SARS-CoV-2 enfeksiyonlarının olduğunun altını çizdi. Bu çalışmalar, aşının bir dozundan sonra hiçbir koruma olmadığı için yeni enfeksiyonlar olduğunu, ancak ikinci dozdan 15 gün sonra çok az yeni enfeksiyon olduğunu gösterdi ve aşının yeni enfeksiyonları önlemede faydalı olduğunu doğruladı. VOC’lerin daha fazla yayılmasını önlemek için mümkün olan en kısa sürede mevcut aşılarla aşılama yapmalıyız. Ayrıca aşıları hedef bölgedeki VOC’lere uyacak şekilde uyarlamak için viral genom sürveyansını da artırmamız gerekiyor. Bunlar, evrensel bir SARS-CoV-2 aşısı geliştirebilene kadar ilk veya destekleyici aşı olarak verilebilir.

COVID-19’un ciddi klinik formlarını tahmin etmeye yardımcı olmak için hastalarda bağışıklık belirteçlerini izlemek neden önemlidir?

Kontrollü hastalık durumunda (çoğunlukla), alveolar makrofajlar, sitotoksik T lenfositler ve spesifik antikorlar, enfekte olmuş hücreleri nötralize etmek ve ortadan kaldırmak için çalışır.

Nadiren kontrolsüz enfeksiyon vakalarında, özellikle interlökin 6 gibi çok yüksek miktarlarda proinflamatuar sitokinler tarafından sistemik enflamasyon tetiklenebilir. Bu fenomen sitokin fırtınası olarak bilinir. Bu sağlıksız bağışıklık tepkisi, bir laboratuvarda interlökin 6, interlökin-1 beta, interferon gama ve TNF alfa gibi ana proinflamatuar sitokinler ölçülerek izlenebilir.

Birçok klinik çalışma, ciddi COVID-19 vakalarında anti-sitokin veya sitokin reseptör bloke edici tedavilerin kullanılmasının etkinliğini göstermiştir. Bir diğer önemli yol, SARS CoV 2 enfeksiyonunda kilit rol oynayan interferon yoludur. Alfa, beta vb. dahil olmak üzere yaklaşık 17 tip I interferon türü vardır. Bunlar, antiviral ve antitümöral bağışıklıkta hayati bir rol oynar ve birçok hücre tipi tarafından, ancak esas olarak plazmasitoid dendritik hücreler tarafından salgılanır. Bu interferonlar, spesifik interferon (A, AR 1 ve 2) reseptörlerine bağlanır ve reseptörün spesifik kinazlar tarafından fosforilasyonunu indükler ve ardından antiviral cevaplar, anti-inflamatuar cevaplar ve düzenleme yolları için farklı gen ifade programlarını kontrol edebilen STAT proteinlerinin devşirilmesini sağlar.

Ne yazık ki, SARS-CoV-2 ve diğer koronavirüsler, virüs tanımayı sağlayan NSP’ler (yapısal olmayan proteinler), reseptöre bağlanmayı engelleyen ORF3a ve STAT1’in nükleer translokasyonunu engelleyen ve ardından interferon etkilerini engelleyen ORF6 gibi proteinler üreterek bu yoldan kaçabilmektedir.

COVID-19 hastalarının yaklaşık %80’i etkili bir bağışıklık tepkisi geliştirir ve asemptomatiktir veya hafif hastalık geliştirirler. Yaklaşık %40’ında dispne ile birlikte ciddi solunum semptomları gelişir ve nadir vakalarda hastaların %5’i akut solunum sıkıntısı sendromu nedeniyle kritik olup, yoğun bakım ünitesine kabul edilir ve sıklıkla çoklu organ yetmezliği veya işlevsizliği ve ölümle sonuçlanır. Yaş, obezite ve diyabet gibi birçok risk faktörü tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bu hastaların klinik evrimini tahmin etmede önemli bir bireysel değişkenlik de vardır; ve bu spesifik öngörücü belirteçleri belirlemek oldukça önem taşımaktadır.

SARS-CoV-2 enfeksiyonuna yanıt olarak genetik belirteçlerin oynayacağı roller?

Bir dizi genetik belirteç, SARS-CoV-2 enfeksiyonunun çeşitli klinik formlarının insan genetik ve immünolojik temelini keşfetmeyi amaçlayan uluslararası bir konsorsiyum olan COVID Human Genetic Effort’u oluşturan Jean-Laurent Casanova ekibi tarafından iyi bir şekilde karakterize edilmiştir.

Grip virüsü pnömonisine karşı Toll-benzeri reseptör (TLR) 3 ve interferon düzenleyici faktör (IRF) 7’ye bağlı tip 1 interferon bağışıklığını yönettiği bilinen 13 insan lokusunda mutasyona bağlı fonksiyon kaybı şiddetli COVID-19 hastalığı ile ilgili bulundu. TLR3, interferon IRF7 ve interferon A reseptörü 1 ve 2’de fonksiyon kaybı varyantı olan ve otozomal resesif veya baskın olan 23 COVID-19 hastası da belirlendi. Hastalar 17 ila 77 yaş arasındaydı ve ekip, bu mutasyonu taşıyan insan fibroblastlarının SARS-CoV-2’ye karşı savunmasız olduğunu gösterdi. Bu nedenle, doğuştan gelen TLR3, IRF7 ve interferon reseptörü 1 ve 2’nin hataları ve tip 1 interferona bağımlı bağışıklık daha önce ciddi enfeksiyon geçirmeyen hastalarda yaşamı tehdit eden COVID-19 pnömonisinin nedeni olabilir.

COVID-19’un ciddi klinik formlarının ortaya çıkmasında tip 1 interferon yolunun önemini vurgulayan açık kanıtlar vardır. Şiddetli COVID-19 vakalarında miyeloid kompartmanın bozulduğu ve bunun sonucunda plazmatik prolaktin gibi yüksek miktarda alarmin üretimi ile immünosupresif bir fenotipe yol açtığı da gösterilmiştir.

KAYANAK: MedicalNews

Acil Durum Değişikliği: COVID-19 mRNA aşılarında “pseudouridin”in rolü

 Gönderi tarihi Ağustos 11, 2021 Hikmet Geçkil tarafından

COVID-19 pandemisinin nedeni olan yeni koronavirüs SARS-CoV-2, insanlık tarihindeki en verimli aşı geliştirme kampanyalarından birine ilham verdi. COVID-19 mRNA aşılarının önemli bir yönü, etkinliklerini artırmak için modifiye edilmiş nükleobaz N1-metilpseudouridin (m1Ψ) kullanılmasıdır (bkz. aşağıdaki şekil). Peki aşılardaki bu sentetik mRNA’larda neden bu taklit urasil analogu (m1Ψ) kullanıldı ve işlevi ne?

Başlayalım…

Psödouridin (Yunanca psi- Ψ veya Q harfi ile kısaltılır), urasil’in bir “azot-karbon” glikozidik bağı yerine bir “karbon-karbon” yoluyla bağlandığı bir nükleozit olan üridinin bir izomeridir. Psödouridin, hücresel RNA’da en bol bulunan RNA modifikasyonudur. Transkripsiyon ve sentezin ardından RNA, kimyasal olarak 100’ün üzerinde farklı modifikasyonla modifiye edilebilir ve psödouridin sadece bunlardan biri ancak en bol bulunanıdır. A, G, C, U dışındaki bu modifikasyonlar, transkripsiyon sonrası potansiyel olarak RNA ifadesini düzenleyebilir ve hücrede RNA’nın translasyonu, konumunu ve karar lılığıdahil olmak üzere çeşitli roller oynayabilir. Bunlardan biri olan psödouridin, üridinde bulunan normal C1-N1 bağından ziyade riboz şekerinin C1’i ile urasil’in C5’i arasında bir CC bağı içeren üridinin C5-glikozit izomeridir:

Psödouridin (Ψ() deki C-C bağı, ona kendi etrafında daha fazla dönme serbestliği ve konformasyonel (yapısal) esneklik sağlar. Ek olarak, psödoüridinin N1 pozisyonunda fazladan bir hidrojen bağı vericisi (kırmızı NH) vardır. 5-ribosilurasil olarak da bilinen psödouridin, yapısal RNA’ların (transfer, ribozomal, küçük nükleer (snRNA) ve küçük nükleolar) yaygın bulunan ancak esrarengiz bir bileşenidir. Son zamanlarda RNA kodlamasında da keşfedilmiştir. Yaşamın 3 filogenetik alanının (domeyn) tümünde (bakteri, arke ve ömkaryotlar) bulunur ve ilk keşfedilendir. Psödouridin, maya tRNA’sındaki nükleotidlerin %4’ünü oluşturur. Bu baz modifikasyonu, ekstra imino grubu aracılığıyla su ile ek hidrojen bağları oluşturarak RNA’yı kararlı kılar ve baz istiflenmesini iyileştirebilir. Escherichia coli rRNA’da 11, maya sitoplazmik rRNA’da 30 ve mitokondriyal 21S rRNA’da tek bir modifikasyon ve insan rRNA’sında yaklaşık 100 psödoüridin vardır, bu da bir organizmanın karmaşıklığı ile psödoüridilasyonun kapsamının arttığını göstermektedir. rRNA ve tRNA’daki psödouridinin, bölgesel yapıya ince ayar yaptığı ve kararlı kıldığı ve mRNA kod çözme, ribozom montajı, işleme ve translasyonda (çeviri) işlevlerinin olduğunu göstermektedir. snRNA’daki psödouridinin, kesme-ekleme düzenlemesini (sıplays) kolaylaştırmak için sıplysozomal RNA-mRNA öncesi etkileşimi arttırdığı gösterilmiştir.

Psödouridin: temel biyolojisinden bir pandeminin en önemli aktörleri olan mRNA aşılarındaki ana röllerine…

11 Aralık 2020’de ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA), şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2’nin (SARS-CoV-2) neden olduğu bir hastalık olan COVID-19’u önlemek için ilk acil kullanım iznini (EUA) yayınladı ve 1 hafta sonra ikinci bir COVID-19 aşısını onayladı. Bu onaylar, halk sağlığı açısından bir atılımı temsil ediyor ve 100 yılı aşkın bir süredir en büyük küresel pandemiye karşı ilk koruyucu önlemleri sağlıyordu. Bu iki aşı, yeni bir terapötik platform olan sentetik mRNA (mRNA) kullanan ilk FDA onaylı terapötikler olmaları açısından da dikkate değerdi.

Haberci (mesajcı) RNA’lar (mRNA’lar), genomun talimatları ile protein üretimi arasındaki merkezi role sahip olup, vücudumuzun her hücresinde kullanılırlar. Sentetik mRNA’lar (örn., aşılardaki) aynı doğal süreçten yararlanır ancak bunlar terapötik etkileri olan proteinleri kodlamak üzere tasarlanmıştır. COVID-19 mRNA aşıları, bunu sağlayan iki mutasyona sahip (K986P ve V987P) tam uzunlukta bir SARS-CoV-2 spike proteini üretir ve böylece antijenik olarak uygun bir prefüzyon (kapalı) konformasyonunda kalır. Enjeksiyon yapılınca mRNA, kas ve bölgeye sızan bağışıklık hücreleri tarafından alınarak spike protein üretmek için kullanılır. (Şekil 1a). Bir transmembran çapası, spike proteinin hücre yüzeyinde görüntülenmesine neden olarak bağışıklık sistemi tarafından onun tanınmasına izin verir. Bu durum, doğal enfeksiyonlara karşı koruma sağlayan ve ciddi hastalıkları önleyen antikorların ve T hücrelerinin üretimini tetikler. Sentetik mRNA’lar, SARS-CoV-2 genomunun yalnızca tek bir bileşenini (yani Spike proteinini) ürettiği için COVID-19’a neden olmazlar. Çünkü bu aşılar, doğal olarak ayrışan ve genomlarla bütünleşmeyen replikasyon yapmayan mRNA’lar içerirler (esasen koronavirüsün kendi mRNA’sı da genoma entegre olacak bir mekanizmaya sahip değildir) .

Şekil 1. (a) mRNA tabanlı COVID-19 aşı stratejisi. (b) Üridin ve m1Ψ’nin yapısal özellikleri. TCR = T hücre reseptörü. MHC = ana doku uyumluluk kompleksi.

mRNA aşılarının kimyasal bileşenleri, göze çarpan iki istisna dışında, esas olarak RNA artı “su, tuz, şeker ve yağ”dan oluşan tekdüze bir içeriktedir. Öne çıkan iki gözalıcı bileşeni, mRNA’yı kapsülleyen ve dağıtımını kolaylaştıran ve başka yerlerde mükemmel bir şekilde incelenen lipid nanoparçacıkları (Nano Partikül, NP) ve bağışıklıktan kaçınmayı ve protein üretimini artıran doğal olmayan bir RNA nükleobaz olan N1-metilpsödouridindir (m1Ψ; Şekil 1b).

COVID-19 mRNA Aşılarının Birincil Yapısı

https://berthub.eu/articles/posts/biontech-pfizer-mrna-a%C5%9F%C4%B1lar%C4%B1n%C4%B1n-kaynak-kodu/

Acil Kullanım izni almış iki COVID-19 mRNA aşısı bulunmaktadır:

• Pfizer-BioNTech’in BNT162b2 (Ticari adı: Comirnaty; jenerik adı: tozinameran
• Moderna’nın mRNA-1273

Pfizer-BioNTech’in BNT162b2 mRNA’sının dizisi açıklanmıştır (Şekil 2). Aşının aktif hali (mRNA), beş ana elementten oluşan 4284 nükleotid doğrusal RNA dizisidir:

1. Genellikle trinükleotid “şapka 1” olarak anılan, ribozomun devşirilmesine ve RNA’nın bozulmaya karşı korunmasına yardımcı olan bir 5′-başlık (m7(3’OMeG)(5′)ppp(5′)(2’OMeA)pG.
2. İnsan alfa-globin mRNA’sından türetilen ve doğru başlangıç ​​(AUG) kodonundan yüksek düzeyde çeviri (translasyon) sağlamaya yardımcı olan optimize edilmiş bir Kozak dizisine sahip çevrilemeyen bir 5′ bölge (UTR).
3. Transmembran (mebrana giren) bağlantılı immünojenik SARS-CoV-2 spike glikoproteininin üretimini belirten, kodonla optimize edilmiş bir kodlama dizisi.
4. Bölünmüş mRNA’nın amino-terminal güçlendiricisinden ve RNA’yı kararlı yüksek düzeyde protein ifadesine yardımcı olan mitokondriyal kodlanmış 12S rRNA’dan türetilen iki diziden oluşan bir 3′-UTR.
5. İki parçalı poli(adenosin) kuyruğundan (dizisinden) oluşan alışılmadık bir 3′-terminali. Poli(adenosin) uzantıları mRNA kararlılığını arttırırken, segmentli yapı plazmit üretimi sırasında istenmeyen rekombinasyonun azaltılmasına yardımcı olur.

Şekil 2. Üst: Sentetik mRNA terapötiklerinde bulunan tasarım öğeleri. Altta: Pfizer/BioNTech’ten COVID-19 mRNA aşısı tozinameran (BNT162b2) dizisi. Yeşil: 5′ kapaklı. Sarı: 5′- ve 3′-UTR dizileri. Mavi: SARS-CoV-2 başak glikoprotein kodlama dizisi. Kırmızı: Parçalı poli(A) kuyruk.

Bu aşıların hızlı tasarımı haklı olarak büyük taktir topladı. Bununla birlikte, şüpheciliğe davetiye çıkarabilecek bu sürecin aceleye geldiği anlatısını nazikçe yapmak önemlidir. Aşağıda, ilk önce bu değiştirilmiş mRNA’ların nasıl yapıldığını gözden geçiriyoruz, ardından modifikasyonun biyolojik etkilerinin bir analizini yapıyoruz.

N1-Metilpseudouridin’in mRNA Aşılarına dahil edilmesi

Yukarıdaki tasarımı değerlendirmek için öncelikle iki teknik zorluğun üstesinden gelmek gerekir:

1. Kimyasal olarak sentezlenebilecek olandan çok daha uzun doğrusal bir diziye sahip sentetik bir mRNA nasıl üretilir?
2. m1Ψ gibi modifiye edilmiş nükleobazları dahil ettiğimizde, bu mRNA işlevini (yani protein için şifre) nasıl koruyabilmektedir?

İlkinin cevabı, doğadan bir ipucu alıp onları enzimatik olarak yapmaktır (Şekil 3). Bu yaklaşım, DNA’nın sentezlenmesinin RNA’dan çok daha kolay olması ve büyük sentetik parçalar halinde birbirine dikilebilmesi gerçeğinden yararlanır. Bu fragmanlar, COVID-19 aşısının kodunun, rekombinant T7 RNA polimeraz (bir bakteri virüsünün enzimi) tarafından mRNA’ya transkripsiyonunu destekleyen bir dizinin akış-aşağı yerleştirildiği plazmitleri oluşturmak için kullanılır. Bu plazmitlerin T7 polimeraz ve nükleotid trifosfatlar (NTP’ler) olan ATP,GTP, CTP, TTP ile inkübe edilmesiyle yüksek verimde mRNA üretilir. Onlarca yıl süren araştırmalar, T7 polimerazın 20000 nükleotitten daha uzun RNA’ları hatasız üretebilen dikkat çekici bir enzim olduğunu ortaya koymuştur.

T7 polimerazın bir diğer özelliği de doğal olmayan NTP’lere tolerans göstermesidir. Bu özelliği de ikinci zorluk olan doğal U yerine modifiye m1Ψ ‘nin zincire yerleştirilmesi için kullanılmıştır (50 yılı aşkın bir süre önce Goldberg ve Rabinowitz, RNA polimerazların psödoüridin trifosfatı RNA’ya dahil edebildiğini gösterdiler).

Eski bir çalışmada psödoüridin, lösemi, gut ve eritrositoz (dolaşımda çok fazla kırmızı kan hücresi bulunması) hastası arafından bağışlanan 20 litre idrardan izole edildi ve karma bir kemoenzimatik yaklaşımla radyoaktif etiketli bir trifosfata dönüştürüdü ve bu modifiye nükleotidin, UTP çıkarıldığında in vitro transkripsiyon sırasında RNA’daki üridinin yerini aldığı bulundu (ayrıca baz eşleşmesini de değiştirmiyordu). Bu enzimatik yaklaşımın bir özelliği, doğal nükleobazı homojen bir şekilde doğal olmayan bir kalıntı ile değiştirmesidir. BNT162b2 durumunda, mRNA’daki her üridin, m1Ψ ile değiştirilir. Bu, terapötik bir mRNA’da faydalı olması anlamına gelir; modifiye edilmiş bir nükleobaz, UTR’ler ve ribozom tarafından tanınan kodlama dizisi dahil olmak üzere tüm fonksiyonel elemanları ile uyumlu olmalıdır. Şimdi, modifiye edilmiş mRNA aşılarının birincil dizisine ve bunların nasıl üretildiğine ilişkin bu anlayışla, ne yaptıklarına ilişkin bir tartışmaya geçebiliriz.

Şekil 3. İn vitro transkripsiyon ile m1Ψ mRNA’ların üretimi. Sol: İn vitro transkripsiyon reaksiyonunun bileşenleri. Sağda: m1Ψ-trifosfatın RNA’ya dahil edilmesi, m1Ψ’nin T7 RNA polimeraz aktif bölgesindeki DNA şablonunun adenini ile kanonik bir baz çifti oluşturma yeteneği tarafından yönlendirilir.

N1-Methylpseudouridine doğal mRNA’nın immunojenitesini azaltır

İlk çalışmalar, katyonik (pozitif yüklü) lipid veziküllerinde tutulan sentetik mRNA’ların kültürlenmiş hücreleri transfekte edilebileceğini gösterdi. Fare kasına enjekte edildiğinde, raportör mRNA’lar haftalarca saptanabilir proteinler üretti. Bununla birlikte, bu ajanların aşı olarak uygulanması ve protein replasman tedavilerinde kullanımları önündeki en büyük zorluk immünojenisiteleriydi. Hücreler, doğal rolü akış-aşağı sinyali indükleyerek viral RNA’ları belirlemek ve bunlara yanıt vermek olan çeşitli motif tanıma reseptörleri içerir. Bunlar, çift ve tek sarmallı RNA’yı tanıyan endozomal reseptörler TLR3, TLR7 ve TLR8’i ve çift sarmallı ve 5′-trifosfatla modifiye edilmiş RNA’yı tanıyan sitozolik reseptörler RIG-I ve MDA-5’i içerir.

Bir bağışıklık tepkisinin uyarılması teorik olarak bir aşı için pozitif bir özellik olsa da, kontrolsüz bağışıklık aktivasyonu alerjik reaksiyonlara ve anafilaktik şoka yol açabilir. Ayrıca moleküler düzeyde, immün sinyalin aşırı uyarılması, antijen ifadesini ve aşı etkinliğini sınırlama potansiyeline sahip olup, bunun protein translasyonunu susturduğu bilinmektedir. Kariko (şu anda Pfizer/BioNTech aşı timindeki sorumlu araştırmacı) ve çalışma arkadaşları psödoüridin, tiouridin ve 5-metilsitidin gibi insan RNA’sında doğal olarak bulunan birçok modifikasyonun bağışıklık sisteminin uyarıcı potansiyelini azalttığını gösterdiler. Bu aynı nükleobaz modifikasyonları, sentetik mRNA’lardan protein üretimini artırabilir ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin üretimi de dahil olmak üzere birçok uygulamada uygulanabilir. Bu kavramın daha da geliştirilmesi, mRNA’da bulunan m1Ψ’ye yol açtı ve bu modifikasyonun TLR3 aktivasyonunu azaltırken protein çıkışını arttırdığı bulundu. m1Ψ ve ilgili modifikasyonların sentetik mRNA’nın immünojenisitesini (antijen gibi yabancı bir maddenin insan veya başka bir hayvanın vücudunda bir bağışıklık tepkisi oluşturma yeteneği) azaltma yeteneği en az üç mekanizmaya bağlanmıştır (Şekil 4):

Şekil 4. (a) mRNA ikincil yapıları tarafından doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin aktivasyonu (b) Bir poliüridin (poli(U)) ligandı ile kompleks halinde tek iplikli RNA sensörü TLR7’nin yapısı (PDB ID: 5GMF). Üridinin m1Ψ ile değiştirilmesi, modifiye nükleobazın TLR7 bağlanması ve immün aktivasyonu ile sterik uyumsuzluğunu gösterir.

Antisens RNA’nın azaltılmış sentezi : Yüksek verimli koşullar altında, T7 RNA polimeraz bazen ürettiği RNA’nın “kendi kendi üstüne eşleşmesine” yol açar, bu da küçük miktarlarda dubleks (çift sarmal) antisens mRNA sentezine yol açar (Şekil 4). Kromatografi ile bu çift sarmallı RNA safsızlıklarını ortadan kaldırırsak, m1Ψ ile modifiye edilmiş ve edilmemiş RNA’lar arasında gözlemlenen immünojenisitedeki farklılıkları ortadan kaldırmaz, ancak bunu azaltır. Diğer çalışmalar ayrıca, baz modifiye NTP’lerin kullanılmasının, saflaştırmaya ihtiyaç duymadan enflamatuar olmayan mRNA’lar verdiğini bulmuştur. Bu durum, RNA sentezi için doğal olmayan NTP’nin kullanılmasının bu yan ürünü olumsuz etkileyebileceğini düşündürmektedir.

Antisens RNA. mRNA’ya komplementer (tamamlayıcı) olan ve böylece ona yapışarak (baz çifti oluşturarak) onun proteine ​​çevrilmesini (translasyon) engelleyen tek zincirli bir RNA

RNA ikincil yapısı ile etkileşimin değiştirilmesi: Antisens safsızlıklara ek olarak mRNA; TLR3 ve RIG-I gibi bağışıklık reseptörleri tarafından tanınabilen saç tokası gibi ikincil yapılar oluşturabilir (Şekil 4). Modifiye bazların dahil edilmesinin potansiyeli bu ikincil yapıları ve protein/çift sarmallı RNA etkileşimlerini değiştirerek bu tanıma olaylarını azaltmak potansiyeli vardır. İlgili C-glikozit psödoüridinde, izomerizasyon, nükleotidin yapısal dengesini bir C3′-endo riboz şekerine ve bazın anti yönelimine doğru kaydırır, bu da sarmallığı ve istiflenmeyi destekleyen bir konformasyondur. Bununla tutarlı olarak, bir yakın zamanda yapılan bir çalışmada, m1Ψ ve üridin içeren RNA’ların farklı ikincil yapılar oluşturduğuna dair kanıt bulmak için kimyasal problama (izleme) reaktifleri kullanılmıştır. Modifiye edilmiş nükleotitlerin, mRNA’ların bağışıklık sinyalini RIG-I yoluyla yayma yeteneğini azalttığı ve bu durumun da onların etkileme yeteneklerinin göstergesi olarak bulunmuştur.

Tek sarmallı RNA bağışıklık reseptörleri ile etkileşimin değiştirilmesi: Bağışıklık hücrelerinde, tek sarmallı poli(üridin) RNA, interferonun en güçlü indükleyicilerinden biridir ve TLR7 tarafından algılanır. m1Ψ’nin bağışıklık tanımayı değiştirip değiştirmediğini belirlemek için m1Ψ içeren RNA’ların enflamatuar gen ifadesini aktive etme kabiliyeti değerlendirildi. Çift sarmallı RNA algılamasının yokluğunda bile, m1Ψ RNA’ları, kanonik üridin içerenlerden daha az enflamatuardı. Bu, m1Ψ tarafından sunulan değiştirilmiş hidrojen bağlama yüzünün ve sterik “yumru”nun TLR7 gibi bağışıklık sensörlerinin tek sarmallı sentetik mRNA segmentleri ile etkileşimini bozduğunu göstermektedir (Şekil 4c).

Birçok çalışmada, bu mekanizmaların her birinin mRNA immünojenisitesine spesifik katkılarının açıkça tanımlanmadığını belirtmek önemlidir. Bu gibi durumlarda, bir mRNA modifikasyonu, etkinliğini antisens transkript sentezini, mRNA yapısını, bağışıklık tanımayı veya bunların bazı kombinasyonlarını değiştirerek uygulayabilir. Aşılar genellikle, ilgilenilen bir antijene yanıt vermek için bağışıklık sistemini hazırlayan maddeler olan adjuvanların birlikte uygulanmasını gerektirir. Tozinameran (Pfizer/BioNTech aşısı) ve mRNA-1273 durumunda, bu rolün, protein üretimini durdurmayan mekanizmalar yoluyla bağışıklık tepkisini tahmin edilebilir şekilde aktive etmek üzere uyarlanabilen lipid nanoparçacığı tarafından yerine getirildiği görülmektedir. Aşının nükleik asit bileşeni, mRNA dizisi bileşiminin aşı etkinliğini etkileme olasılığını azaltır.

İlginç bir şekilde, başka iki çalışma m1Ψ’nin doğal analoğu olan psödoüridinin in vivo mRNA immünojenisitesini ölçülebilir bir şekilde değiştirmediğini ve m1Ψ’nin faydalarının çoğunun basitçe üridin içeren kodonların sayısını mühendislik yapıp azaltarak elde edilebileceğini bildirdi. SARS-CoV-2 genomu tarafından kodlanan spike glikoproteine ​​nazaran tozinameran’da kullanılan kodonların karşılaştırmalı bir analizi, doğal üridinlerin orantısız bir şekilde tükenmesini halbuki modifiye m1Ψ’nin daha kalıcı olduğunu ortaya koydu (Şekil S1). COVID-19 aşısı bağlamında, dizi mühendisliğinin ve m1Ψ dahil edilmesinin yukarıda belirtilen immünojenik mekanizmalar üzerindeki nispi etkileri henüz rapor edilmemiştir.

N1-Metilpseudouridin mRNA Translasyonunu (proteine çeviri) Değiştirebilir

Bir mRNA ilacının nihai amacı, terapötik bir proteini ifade etmektir. Bu nedenle, m1Ψ ve diğer modifiye bazlar, ribozom yoluyla mRNA’nın proteine ​​çevrilmesini kolaylaştırma yetenekleri açısından araştırılmıştır. Bağışıklık aktivasyonu, ribozomu kapatarak ve mRNA’yı bozan ribonükleazları aktive ederek translasyonu sınırlayabileceğinden, bu çalışmalar doğal olarak yukarıdakilerle iç içedir. Bununla tutarlı olarak, m1Ψ içeren mRNA’nın yüksek düzeyde protein üretimi sağladığının bulunduğu ilk raporda, bu kısmen TLR3 aktivasyonunu köreltme (inhibe) yeteneğine atfedilmiştir. m1Ψ’nin dahil edilmesinin poliszomların (mRNA’ya art arda bağlanmış çok sayıda ribozom) büyüklüğünü ve bolluğunu arttırdığı gözlemlendi, bu da m1Ψ mRNA’larının daha hızlı translasyon başlatması ve daha yavaş uzamasının onların yarı ömürlerini arttırmanın yanı sıra ribozom ile üretken etkileşimleri indükler. Bu çalışmalar, m1Ψ’nin mRNA translasyonunu doğrudan etkileyebileceğine dair ilk kanıtı sağladı. 5′-UTR’lerde olduğu gibi, m1Ψ’nin yapıyı stabilize ettiği bulundu. Daha ileri çalışmalar, m1Ψ tarafından uygulanabilen kodlama dizisindeki ikincil yapının, kodon optimalliğinden bağımsız olarak mRNA fonksiyonel yarı ömrünü artırabileceği bir model için destek sağlamıştır.

Şekil 5. m1Ψ, çeviri üzerinde bağlama bağlı etkiler uygular. Sol: Sentetik mRNA’ların 5′-UTR’sinde ikincil yapının m1Ψ’ye bağlı olarak uygulanması, çevirinin başlamasını engelleyebilir. Sağda: Sentetik mRNA’ların kodlama dizilerinde ikincil yapının m1Ψ’ye bağlı olarak uygulanması, işlevsel yarı ömürlerini artırabilir. Not: m1Ψ, sentetik mRNA aşıları boyunca homojen bir şekilde dahil edilirken, bu çizimlerde, m1 only, mRNA yapısını etkileme potansiyelini vurgulamak için yalnızca duplekslerde belirtilmiştir.

Bu çalışmaların ortaya koyduğu önemli bir husus, m1Ψ’nin protein üretimi için her derde deva olmadığıdır. Çoğu mRNA dizisi için m1Ψ, üridinden daha iyi performans gösterirken, bazılarında daha kötü performans gösterdi. Bir çalışmada 5′-UTR bölgelerinde yapılandırılmış viral dahili ribozomal giriş bölgeleri içeren mRNA’lardan gelen protein çıkışı ile uyumsuz olduğu bulunan psödoüridin için de benzer gözlemler yapılmıştır. Birçok farklı m1Ψ içeren mRNA’nın verimli translasyonu bu modifikasyonun neden olduğu ikincil yapıların bağışıklık sensörlerini etkinleştirmediğini göstermektedir. Bu durum, poli(I:C) gibi klasik TLR3 agonistlerinde bulunan kararlı çift sarmallara göre küçük boyutlarını veya daha büyük dinamiklerini veya m1Ψ’nin immün aktivasyondan sorumlu protein-mRNA etkileşimlerini engelleme konusundaki içsel kabiliyetini yansıtabilir.

Sonuç

COVID-19 pandemisinin şoku, biyomedikal araştırma camiasını benzeri görülmemiş bir ölçekte harekete geçirdi ve insanlık tarihindeki en hızlı aşı üretim sürecini mümkün kıldı. Modifiye edilmiş nükleobaz, istenmeyen bağışıklık uyarımlarını sınırlayarak mRNA aşılarının bağışıklık sisteminden gizlenmesine yardımcı olur ve belirli durumlarda hücrenin protein üreten mekanizması tarafından antijenlerin sentezini de artırabilir. Bu durum, bu aşıların, anafilaksi gibi zararlı yan etkileri tetiklemeden, doğal mRNA translasyonu sürecine girmesine izin verir. Ortaya çıkan SARS-CoV-2 varyantlarına ilişkin mevcut endişeler ışığında, kişiselleştirilmiş kanser immünoterapisinde kullanılmak üzere sentetik mRNA’ların nasıl geliştirildiğini vurgulamakta fayda var. Bu yaklaşımda, klinisyenler bir tümörü çıkarır, tanımlamak için sıralar. Bu bilgiyi yüksek seviyelerde mutant peptitleri ifade eden özel mRNA’lar tasarlamak için kullanırlar ve bu da bağışıklık sisteminin seçici olarak tümör dokusuna saldırması için eğitilmesine yardımcı olur. Başka bir deyişle, sentetik mRNA platformları, yeni keşfedilen mutasyonları hızla ele alıyor. Bu durum, bu ilaçların ortaya çıkan viral suşlarla mücadele etmek için yeniden tasarlama potansiyeline işaret ediyor ve bu pandeminin beklenmedik bir mirasının kanser tedavisinde sentetik mRNA’ların kullanımını hızlandırmak olabileceğini düşündürüyor. Son olarak, m1Ψ incelememiz, kimyasal inovasyonun terapötik mRNA’ların erişimini genişletmeye yardımcı olabileceği gelecekteki alanları vurgulamaktadır. Birincisi, mRNA aşılarının modüler doğası dikkate değer bir coşkuya yol açmış olsa da, etkinliklerine katkıda bulunan elementlerin (başlıklar, kodlama dizileri, kodonlar, UTR’ler ve modifikasyonlar dahil) kombinatoryal alanı ölçek olarak büyüktür. Yüksek çıktılı yaklaşımlar, bu alanı tanımlamaya ve optimize edilmiş ajanlar geliştirmeye yardımcı olmak için kritik olacaktır. Yeni mRNA terapilerinin üretimine, genişletilmiş nükleobaz toleransı veya azaltılmış antisens transkript üretimi gibi gelişmiş sentetik özelliklere sahip RNA polimerazların evrimi de yardımcı olabilir.

Kaynak

Modifications in an Emergency: The Role of N1-Methylpseudouridine in COVID-19 VaccinesModifications in an Emergency: The Role of N1-Methylpseudouridine in COVID-19 Vaccines

Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2, Wuhan-Hu-1’i izolatının komple (tam) genomu)

Reverse Engineering the source code of the BioNTech/Pfizer SARS-CoV-2 Vaccine

Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 Spike Protein CDS1:

siddetli-akut-solunum-sendromu-koronavirus-2-spike-protein-cds1Download

• Pfizer/BioNTech Aşısı (A Phase 1/2/3 Study to Evaluate the Safety, Tolerability, Immunogenicity, and Efficacy of RNA Vaccine Candidates Against COVID-19 in Healthy Individuals)

pfizervaxDownload