PCR’a Giriş

 Gönderi tarihi Nisan 27, 2021 Hikmet Geçkil tarafından

MAKALE   17 Mar 2021 | Arianna Ferrini www.technologynetworks.com/

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), moleküler biyoloji dünyasında ve ötesinde devrim yaratan bir tekniktir. Bu makalede, farklı PCR türlerini ve bunların uygulandıkları özel amaçları vurgulayarak kısa bir PCR tarihçesini ve ilkelerini tartışacağız.

PCR’ın prensipleri ve tarihçesi
Standart PCR deneyine genel bakış
PCR varyasyonları
    – Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR)
    – Revers (ters) transkripsiyon-PCR (RT-PCR)
    – Revers transkripsiyon-kantitatif PCR (RT-qPCR)
    – Dijital PCR (dPCR) ve dijital damlacık PCR (ddPCR)
    – Mikroakışkan PCR

PCR sorun giderme
PCR çıkış uygulamaları

---

PCR’ın prensipleri ve tarihçesi

1983’te Amerikalı biyokimyacı Kary Mullis, gece geç saatlerde eve doğru giderken ona bir ilham parıltısı çarptı. Bir makbuzun arkasına, sonunda kendisine 1993’te Nobel Kimya Ödülü verecek fikri yazdı. Kavram basitti: hücrelerde gerçekleşen DNA replikasyon sürecini bir laboratuar tüpünde çoğaltmak. Sonuç aynı: mevcut olanlara dayalı yeni tamamlayıcı DNA (cDNA) zincirlerinin oluşturulması.

Mullis, yeni tekniği için bir başlangıç ​​noktası olarak Sanger’in DNA dizilemesini temel yaklaşım olarak kullandı. DNA polimerazın tekrarlanan kullanımının, belirli bir DNA segmentinin amplifikasyonuyla (çoğaltılmasıyla) sonuçlanan bir zincir reaksiyonunu tetiklediğini fark etti.

Bu fikrinin temelleri, 1976 yılında, kaplıcalarda bulunan Thermus aquaticus bakterisinden izole edilmiş, termostabil DNA polimeraz Taq’ın keşfedilmesiyle atıldı .1 Taq DNA polimeraz 72 °C optimum sıcaklığa sahiptir ve 96 °C’ye kadar uzun süre maruz kalmaya dayanır, bu da birkaç denatürasyon döngüsünü tolere edebileceği anlamına gelir.

Taq polimerazın keşfinden önce , moleküler biyologlar döngüsel DNA amplifikasyon protokollerini optimize etmeye çalışıyorlardı ancak enzim, DNA denatürasyonu için gereken yüksek sıcaklıklara dayanamadığı için her döngüde taze polimeraz eklemeye ihtiyaçları vardı. Termostabil (sıcaklığa dayanıklı) bir enzime sahip olmak, amplifikasyon sürecini her döngüde taze polimeraza ihtiyaç duymadan defalarca tekrarlayabilecekleri anlamına geliyordu, bu da tüm süreci ölçeklenebilir, daha verimli ve daha az zaman alıcı hale getiriyordu.

Kullanarak bu polimeraz zincir reaksiyonu ilk tanımı (PCR) , Taq polimeraz, 1985 Science yayınlanan2 1993 yılında ilk FDA onaylı PCR kiti piyasaya çıktı. O zamandan beri, PCR istikrarlı ve sistematik olarak geliştirildi. Adli kanıt analizi ve teşhisten hastalık izleme ve genetik mühendisliğine kadar her şeyde oyun kurucu hale geldi . Bu, kuşkusuz 20. yüzyılın en önemli bilimsel gelişmelerden biri olarak kabul edilmektedir.

Standart PCR deneyine genel bakış

PCR, şablon yada kalıp DNA adı verilen karmaşık bir başlangıç ​​malzemesi karışımından belirli bir DNA parçasını amplifiye etmek için kullanılır. Örnek hazırlama ve saflaştırma protokolleri, örnek matrisi ve hedef DNA’nın erişilebilirliği dahil olmak üzere başlangıç ​​materyaline bağlıdır. Genellikle minimum DNA saflaştırması gerekir. Bununla birlikte, PCR, amplifiye edilecek DNA fragmanını (hedef DNA olarak adlandırılır ) çevreleyen DNA dizi bilgilerinin bilinmesini gerektirir .

Pratik bir bakış açısından, bir PCR deneyi nispeten basittir ve birkaç saat içinde tamamlanabilir. Genel olarak, bir PCR reaksiyonunun beş ana reaktife ihtiyacı vardır:

Amplifiye edilecek DNA: PCR şablonu veya şablon DNA olarak da adlandırılır. Bu DNA, genomik DNA (gDNA), cDNA ve plazmid DNA gibi herhangi bir kaynaktan olabilir . 

DNA polimeraz: Tüm PCR reaksiyonları, yüksek sıcaklıklarda çalışabilen bir DNA polimeraz gerektirir. Taq polimeraz, yaygın olarak kullanılan bir enzim olup, 70 ° C’de 60 baz/saniye hızında nükleotitleri birleştirir (polimerizasyon) ve 5 kb’ye kadar şablonları çoğaltabilir, bu da onu özel gereksinimler olmadan standart PCR için uygun hale getirmektedir. Reaksiyon performansını iyileştirmek için yeni nesil polimerazlar tasarlanmaktadır. Örneğin bazıları, reaksiyonun başlangıcında spesifik olmayan amplifikasyonu azaltmak için yalnızca yüksek sıcaklıklarda etkinleştirilecek şekilde tasarlanmıştır. Diğerleri, örneğin çoğaltılan dizinin şablon diziyle tam olarak eşleşmesinin kritik olduğu durumlarda, örneğin klonlama sırasında önemli olan bir “düzeltme okuma” işlevi içerir.

Primerler: DNA polimerazlar, amplifikasyonu nerede başlatmaları gerektiğini belirtmek için kısa bir nükleotid dizisi gerektirir. Bir PCR’de, bu dizilere primerler denir ve kısa tek sarmallı DNA parçalarıdır (yaklaşık 15-30 baz). Bir PCR deneyi tasarlarken, araştırmacı, DNA’nın amplifiye edilecek bölgesini belirler ve biri ön iplikçikte (ileri primer) diğeri arka iplikçikte (geri primer) olmak üzere, özellikle hedef bölgeyi çevreleyen bir çift primer tasarlar. Primer tasarımı, bir PCR deneyinin önemli bileşenidir ve dikkatlice yapılmalıdır. Primer dizileri, benzer bir diziye bağlanma olasılığından kaçınarak, ilgilenilen benzersiz DNA’yı hedefleyecek şekilde seçilmelidir. Benzer erime sıcaklıklarına sahip olmaları gerekir çünkü tavlama (belli bir sıcaklığa kadar ısıtılıp sonra soğutulma) aşaması her iki şerit için aynı anda gerçekleşir. Bir primerin erime sıcaklığı, adenin A=T baz çiftleri için düşük, G=C baz çiftleri için yüksektir. Dolayısı ile yüksek GC içeriğine sahip DNA kalıpları yüksek erime sıcaklıklarına sahiptir. PCR verimliliğini azaltacağından ikincil yapılar veya primer dimerleri oluşturma eğiliminde olan dizilerden kaçınmak önemlidir. Primer tasarımına yardımcı olacak birçok ücretsiz çevrimiçi araç mevcuttur.

Deoksinükleotid trifosfatlar (dNTP’ler): Bunlar, yeni DNA ipliklerini (zincir) sentezlemek için yapı taşları görevi görür ve dört temel DNA nükleotidini (dATP, dCTP, dGTP ve dTTP) içerir. dNTP’ler, optimum baz katılımı için genellikle eşmolar miktarlarda PCR reaksiyonuna eklenir.

PCR tamponu: PCR tamponu, PCR reaksiyonu boyunca optimum koşulların korunmasını sağlar. PCR tampon ana bileşenleri magnezyum klorid (MgCl2 ), tris-HCl ve potasyum klorür (KCl)’dür. MgC2 DNA polimerazı için bir kofaktör olarak görev yaparken, tris-HCI ve KCl reaksiyon esnasında sabit bir pH değerini muhafaza eder. PCR reaksiyonu, yukarıda belirtilen reaktiflerin karıştırılması ve tüpün bir termal döngüleyiciye (termal sayklır, thermal cycler) yerleştirilmesiyle tek bir tüp içinde gerçekleştirilir.

PCR amplifikasyonu, üç tanımlanmış zaman ve sıcaklık setinden oluşur: denatürasyon (eritme) , tavlama (yapışma) ve uzatma (Şekil 1).

Şekil 1: Tek bir PCR döngüsünün adımları.

Bu aşamaların her biri, döngü (saykıl, cycle) olarak isimlendirilen sayılarda 30-40 kez tekrarlanır, amplifikasyon (Şekil 2), her bir döngüde DNA miktarını ikiye katlanarak DNA amplifiye edilmiş (çoğaltılmış) olur.

Şekil 2: PCR ile DNA molekülü amplifikasyonunun farklı aşamaları ve döngüleri.

Her adıma daha yakından bakalım.

1.       Denatürasyon

Denatürasyon adı verilen PCR’nin ilk adımı, şablon DNA’yı birkaç saniye boyunca 95 ° C’ye kadar ısıtır ve iki DNA zincirinin (sarmal) arasındaki hidrojen bağları hızla kırılırken iki DNA ipliğini ayırır.

2.       Tavlama

Reaksiyon karışımı daha sonra 30 saniye ile 1 dakika arasında soğutulur. Tavlama sıcaklıkları genellikle 50 – 65 ° C’dir, ancak kesin optimum sıcaklık primerlerin uzunluğuna ve sırasına bağlıdır. Her yeni primer setiyle dikkatlice optimize edilmelidir.

İki DNA zincirleri olabilir bu sıcaklıkta katın, ancak karışım primerler bağlayan ya da tavlama büyük bir fazlalığı içerdiği için en spesifik tamamlayıcı konumlarda şablon DNA’ya, yok. Tavlama aşaması tamamlandığında, şablon DNA ve primerler arasında hidrojen bağları oluşacaktır. Bu noktada polimeraz, DNA dizisini genişletmeye hazırdır.

3.       Uzatma

Daha sonra sıcaklık, tipik olarak yaklaşık 72 °C veya karışımdaki DNA polimeraziçin ideal çalışma sıcaklığına yükseltilir (ör. Taq Pol için 74 °C).

DNA polimeraz, her bir primerin bir ucuna bağlanır ve şablon DNA’yı tamamlayan yeni DNA zincirlerini sentezler. İlk raunt sonrası, başlangıçta mevcut olan iki zincir yerine dört DNA zinciri bulunacaktır.

Sıcaklık tekrar 94 °C’ye yükseltilir ve çift sarmallı DNA molekülleri (hem “orijinal” moleküller hem de yeni sentezlenenler) yeniden tek zincirler halinde denatüre olurlar. Bu durum, ikinci denatürasyon-tavlama-uzatma döngüsünü başlatır. Bu ikinci döngünün sonunda, tek zincirli DNA’nın sekiz molekülü vardır. Döngünün 30 kez tekrarlanmasıyla, başlangıçta bulunan çift sarmallı DNA molekülleri, her biri iki primerin tavlama bölgeleri tarafından tanımlanan başlangıç ​​molekülünün bölgesinin bir kopyası olan 130 milyondan fazla yeni çift sarmallı moleküle dönüştürülür.

Amplifikasyonun başarılı olup olmadığını belirlemek için, PCR ürünleri, amplikon varlığını / yokluğunu, boyutunu ve yaklaşık bolluğunu gösteren jel elektroforezi kullanılarak görselleştirilebilir. Uygulamaya ve araştırma sorusuna bağlı olarak, bu, örneğin bir genin mevcut olup olmadığını belirlerken bir deneyin son noktası olabilir. Aksi takdirde, PCR ürünü, dizi analizi ve klonlama gibi daha karmaşık aşağı akış araştırmaları için sadece başlangıç ​​noktası olabilir.

PCR varyasyonları

Çok yönlülüğü sayesinde, PCR teknikleri son yıllarda gelişti ve birkaç farklı PCR teknolojisinin geliştirilmesine veya birkaç farklı tipte PCR teknolojisine yol açtı.

En çok kullanılanlardan bazıları şunlardır:

Kantitatif gerçek-zamanlı (real-time) PCR (qPCR)

En yararlı gelişmelerden biri nicel (kantitatif) gerçek-zamanlı PCR veya qPCR olmuştur. Adından da anlaşılacağı gibi qPCR, amplifikasyon sürecinin gerçek-zamanlı izlenmesine ve PCR ürünlerinin yapıldıkça tespit edilmesine izin veren nicel (kantitatif) bir tekniktir. 2 Hedef DNA’nın başlangıç ​​konsantrasyonunu belirlemek için kullanılabilir ve birçok durumda jel elektroforezi ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu işlem, çift ​​sarmallı DNA’ya bağlandığında floresan ışığı veren SYBR® Green veya hidroliz (TaqMan) probları ve moleküler etiketler gibi DNA oligonükleotit sekansına özgü floresan probları ve spesifik olmayan floresan boyaları DNA çift zinciri yapıldıkça ona katan boyaların dahil edilmesi sayesinde elde edilir. Problar, amplikon içindeki DNA hedef dizilerine spesifik olarak bağlanır ve bir ucunda bir floresan molekülün ve diğer ucunda bir söndürücü (quencher) bağlantısıyla floresan oluşturmak için Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) prensibini kullanır. Hem floresan boyalar hem de problar için, hedef DNA’nın kopya sayısı arttıkça, floresan seviyesi orantılı olarak artar ve bilinen kopya sayısını içeren standartlar referans alınarak amplifikasyonun gerçek zamanlı nicelendirilmesi yaplır (Şekil 3).

qPCR, amplifikasyon gerçekleşirken floresan sinyali izleyen floresan algılama sistemleriyle donatılmış özel termal döngüleyiciler kullanır.

Şekil 3: Örnek qPCR amplifikasyon grafiği ve bilinmeyen örneklerde kopya sayısının ölçülmesini sağlamak için kullanılan standart eğri.

Revers (ters) transkripsiyon-PCR (RT-PCR)

Revers transkripsiyon (RT)-PCR ve RT-qPCR, hem klinik hem de araştırma ortamlarında, gen transkripsiyon analizi ve viral RNA miktarının belirlenmesini sağlayan, yaygın olarak kullanılan iki PCR çeşididir.

RT, tek sarmallı şablon RNA’dan 3 cDNA yapma sürecidir ve dolayısıyla birinci zincir cDNA sentezi olarak da adlandırılır. RT-PCR’nin ilk adımı, RNA şablonu ve bir DNA oligonükleotid primeri arasında bir DNA/RNA hibrit sentezlemektir. Bu reaksiyonu katalize eden revers transkriptaz enzimi, daha sonra hibridin RNA kısmını bozan RNaz aktivitesine sahiptir. Daha sonra, tek sarmallı bir DNA molekülü, revers transkriptazın DNA polimeraz aktivitesi ile sentezlenir. Başarılı bir RT-PCR için yüksek saflık ve kaliteli başlangıç ​​RNA’sı gereklidir.

RT-PCR, iki yaklaşımı takiben gerçekleştirilebilir: tek adımlı RT-PCR ve iki adımlı RT-PCR. İlk durumda, RT reaksiyonu ve PCR reaksiyonu aynı tüpte meydana gelirken, iki aşamalı RT-PCR’de iki reaksiyon ayrıdır ve arka arkaya gerçekleştirilir.

Revers transkripsiyon-kantitatif PCR (RT-qPCR)

Yukarıda açıklanan ters transkripsiyon genellikle qPCR’de ilk adım olarak işlev görür ve biyolojik numunelerde RNA’nın miktarını belirler (RNA transkriptleri veya viral RNA genomlarından türetilmiş).

RT-PCR ile olduğu gibi, RNA’yı RT-qPCR ile ölçmek için iki yaklaşım vardır: tek adımlı RT-qPCR ve iki adımlı RT-qPCR. Her iki durumda da RNA, önce qPCR amplifikasyonu için şablon olarak kullanılan cDNA’ya revers transkripsiyona tabi tutulur. İki aşamalı yöntemde, revers transkripsiyon ve qPCR amplifikasyonu, iki ayrı deney olarak sırayla gerçekleşir. Tek adımlı yöntemde RT ve qPCR aynı tüpte gerçekleştirilir. 

Dijital PCR (dPCR) ve dijital-damlacık PCR (ddPCR)

Dijital PCR (dPCR), orijinal PCR protokolünün başka bir uyarlamasıdır. 4 qPCR gibi, dPCR teknolojisi de bir primer seti ve problar kullanarak karmaşık bir numuneden hedef DNA’yı amplifiye etmek için DNA polimeraz kullanır. Bununla birlikte, temel fark, PCR reaksiyonlarının bölümlendirilmesinde ve sonunda veri toplamada yatmaktadır.

dPCR ve ddPCR, sınırlayıcı seyreltme kavramına dayanmaktadır. PCR reaksiyonu, çok sayıda nanolitre boyutlu alt reaksiyonlara (bölümler) bölünmüştür. PCR amplifikasyonu her damlacığın içinde gerçekleştirilir. PCR’yi takiben, her damlacık, orijinal örnekteki PCR-pozitif damlacıkların yüzdesini belirlemek için Poisson istatistikleri ile analiz edilir. Bazı bölümler hedefin bir veya daha fazla kopyasını içerebilirken, diğerleri hiç hedef sekans içermeyebilir. Bu nedenle bölümler, pozitif (hedef tespit edildi) veya negatif (hedef tespit edilmedi) olarak sınıflandırılır ve bir dijital çıktı formatı için temel oluşturur.

ddPCR, 2011’de kullanıma sunulan yeni bir teknolojidir. 5 ddPCR, şablon DNA moleküllerini ayıran bölümleri oluşturmak için bir su-yağ emülsiyonunu kullanır. Damlacıklar, esasen PCR reaksiyonunun gerçekleştiği ayrı test tüpleri görevi görür.

Mikroakışkan PCR

Mikrokanallı ve mikro odacıklı mikroakışkan işleme sistemlerinin yakın zamandaki gelişimi, mikroakışkan çipler üzerinde PCR yoluyla DNA’nın amplifikasyonu dahil olmak üzere bir dizi pratik uygulamanın yolunu açmıştır.

Bir çip üzerinde gerçekleştirilen PCR, mikroakışkanların hız, hassasiyet ve düşük reaktif tüketimindeki avantajlarından yararlanır. Bu özellikler, mikroakışkan PCR’yi özellikle bakım noktası testleri için, örneğin teşhis uygulamaları için çekici hale getirir. Pratik bir bakış açısıyla, numune, PCR’nin farklı adımlarını yansıtan üç sıcaklık bölgesinden tekrar tekrar geçerek mikroakışkan bir kanaldan akar. 10 μL’lik bir numunenin 20 PCR döngüsü gerçekleştirmesi sadece 90 saniye sürer. 6 Sonraki analiz daha sonra çip dışında kolaylıkla gerçekleştirilebilir.

PCR sorunlarını giderme

Farklı PCR yaklaşımlarının hepsinin, uygun oldukları uygulamaları etkileyen avantajları ve dezavantajları vardır 7 . Bunlar Tablo 1’de özetlenmiştir.

Yaklaşmak	Avantajlar	Sınırlamalar
PCB	·   Gerçekleştirilecek en kolay PCR ·   Düşük ekipman ve reaktif maliyeti ·   Çeşitli aşağı akış uygulamaları (örneğin, klonlama)	·  Sonuçlar yalnızca nitelikseldir ·  Süreyi ve hata riskini artıran amplifikasyon sonrası analizler gerektirir ·  Ürünlerin sıralamayla doğrulanması gerekebilir
qPCR	·  Kantitatif sonuçlar üretir·  Prob kullanımı yüksek özgüllük sağlayabilir·  Yüksek analitik hassasiyet·  Düşük geri dönüş süresi·  Amplifikasyon sonrası analiz için gereksinimleri ortadan kaldırır	·  Daha pahalı reaktifler ve ekipman gerektirir ·  Primer ve prob seçiminde az esneklik ·  Amplikonun küçük uzunluğu nedeniyle diğer aşağı akış ürün onay analizlerine (sıralama gibi) daha az uygundur ·  Klonlama gibi bazı aşağı akış uygulamaları için uygun değildir
RT-PCR ve RT-qPCR	·  Tüm RNA türleri ile kullanılabilir	·  RNA bozulmaya eğilimlidir ·  RT adımı, kontaminasyon süresini ve potansiyelini artırabilir
dPCR ve ddPCR	·  Hızlı ·  DNA saflaştırma adımı yok ·  Mutlak miktar tayini sağlar ·  Sınırlı klinik numunelerde hedefi tespit etmek için artan hassasiyet ·  Son derece ölçeklenebilir	·  Maliyetli ·  Birkaç istatistiksel varsayıma dayalı
Mikroakışkan PCR	·  Hızlandırılmış PCR süreci ·  Azaltılmış reaktif tüketimi ·  Yüksek verim için uyarlanabilir ·  Noktası bakım uygulamaları için taşınabilir aygıt ·  Tek hücreli analize izin verir	·  Hala çok yeni teknoloji ·  Kalıntıları ve istenmeyen bileşikleri gidermek için kapsamlı numune hazırlığı gerektirir ·  Yüksek sıcaklıklar nedeniyle mikroakışkan cihaz için sınırlı malzeme seçimi

Tablo 1: Farklı PCR yaklaşımlarının temel avantajları ve dezavantajları.

PCR çıktı uygulamaları

PCR, modern moleküler biyolojide vazgeçilmez bir araç haline geldi ve bilimsel araştırmaları tamamen dönüştürdü. Teknik, aynı zamanda hücresel ve moleküler süreçlerin araştırılmasını moleküler biyoloji alanı dışında çalışanlara da açtı ve sonuç olarak birçok disiplinde bilim adamları tarafından da kullanım alanı buldu.

PCR kendi başına güçlü bir bağımsız teknik olsa da, bu iş akışlarının küçük ama önemli bir parçası olarak klonlama ve dizileme gibi daha geniş tekniklere de dahil edilmiştir.

PCR’nin araştırma uygulamaları şunları içerir:

Gen transkripsiyonu –  PCR ile belirli bir zaman noktasında hücre tipleri, dokular ve organizmalar arasındaki gen transkripsiyonundaki varyasyonlar incelenebilir. Bu süreçte RNA, ilgili örneklerden izole edilir ve cDNA’ya revers transkripsiyon yapılır. Spesifik bir gen için orijinal RNA seviyeleri daha sonra PCR’de amplifiye edilen (çoğaltılan) cDNA miktarından ölçülebilir.

Genotipleme –  PCR ile belirli hücrelerin veya organizmaların alellerinde (gen kopyaları) dizi değişiklikleri tespit edilebilir. Yaygın bir örnek, “knock-out” ve “knock-in” fareler gibi transgenik organizmaların genotiplendirilmesidir. Bu uygulamada, primerler ya bir transgen bölümünü (bir transgenik hayvanda) ya da mutasyonu (mutant bir hayvanda) çoğaltmak için tasarlanmıştır. 

Klonlama ve mutagenez – PCR klonlama, PCR ile amplifiye edilen çift sarmallı DNA parçalarının vektörlere (örn., GDNA, cDNA, plazmid DNA) yerleştirildiği yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu uygulama, örneğin, genetik materyalin çıkarıldığı veya eklendiği bakteri suşlarının oluşturulmasını sağlar. Bölgeye yönelik (site-directed) mutagenez, klonlama yoluyla nokta mutasyonlarını tanıtmak için de kullanılabilir. Bu genellikle, üst üste binen primerlerin baz ikamelerini dahil etmek için özel olarak tasarlandığı rekombinant PCR olarak bilinen bir tekniği kullanır (Şekil 4). Bu teknik, yeni gen füzyonları oluşturmak için de kullanılabilir. 

Şekil 4: Rekombinant PCR’nin bir örneğini gösteren diyagram.

Dizileme – PCR, baz dizisini çıkarmak için snırlı kopyadaki şablon DNA’yı çoğaltmak için kullanılabilir. Dizileme şablonlarının hazırlanması için önerilen PCR türü, yüksek kaliteli PCR olarak adlandırılır ve DNA dizi doğruluğunu koruyabilir. Sanger dizilemede, PCR ile çoğaltılmış fragmanlar daha sonra saflaştırılır ve bir dizileme reaksiyonunda çalıştırılır. Yeni nesil dizilemede (NGS), PCR, DNA örneklerinin başlangıç ​​miktarını artırmak için PCR ile zenginleştirildiği ve çoğullamaya izin vermek için dizileme adaptörleri ile etiketlendiği kitaplık hazırlama aşamasında kullanılır. Bridge (Köprü) PCR, ikinci nesil NGS dizileme sürecinin de önemli bir parçasıdır.

PCR, hem bağımsız bir teknik hem de diğer metotlar içinde bir yük beygiri olarak bir dizi disiplini dönüştürmüştür:

Genetik araştırma  – PCR, dünya çapındaki çoğu laboratuvarda kullanılmaktadır. En yaygın uygulamalardan biri , belirli gen transkriptlerinin varlığını veya bolluğunu değerlendirmeyi amaçlayan gen transkripsiyon analizidir 9 . Klonlama yoluyla organizmaların – hayvan, bitki ve mikrop – genetik dizisini manipüle etmede güçlü bir tekniktir. Bu, genlerin veya genlerin bölümlerinin, fenotipleri değiştirmesi, gen işlevlerini aydınlatması ve bunlardan sadece birkaçı olan aşıların geliştirilmesi için genetik belirteçlerde mühendisliğe tabi tutulması için eklenmesini, silinmesini veya mutasyona uğratılmasını sağlar. Genotiplemede PCR, spesifik hücreler veya organizmalardaki alellerde sekans varyasyonlarını tespit etmek için kullanılabilir. Kullanımı da insanlarla sınırlı değildir. Tarımda genotipleme bitkileribitki yetiştiricilerine üreme stoklarını seçme, rafine etme ve geliştirme konusunda yardımcı olur. PCR ayrıca, yukarıda tartışıldığı gibi sekanslama örneklerini zenginleştirmenin ilk adımıdır. Örneğin, İnsan Genom Projesindeki (HGP) çoğu haritalama tekniği PCR’ye dayanıyordu.

Tıp ve biyomedikal araştırma  – PCR, hastalıkla ilişkili genetik mutasyonlar için teşhis testlerinden bulaşıcı ajanların tanımlanmasına kadar birçok tıbbi uygulamada kullanılır. Tıbbi alanda PCR kullanımının bir başka harika örneği, doğum öncesi genetik testtir. Doğum öncesi genetik test
PCR aracılığıyla fetustaki kromozom anormalliklerini ve genetik mutasyonları belirleyebilir ve aday ebeveynlere bebeklerinin belirli genetik bozuklukları olup olmadığı hakkında önemli bilgiler verebilir. PCR, embriyoları in vitro fertilizasyon (IVF) prosedürleri için taramak üzere bir preimplantasyon genetik tanı aracı olarak da kullanılabilir .

Adli bilim  – Benzersiz genetik parmak izlerimiz (DNA blueprint), örneklerin kaynaklarını tam olarak belirlemek için PCR’nin hem babalık testlerinde hem de adli araştırmalarda etkili olabileceği anlamına gelir. Bir olay yerinden izole edilen küçük DNA örnekleri, örneğin bir DNA veritabanıyla veya şüphelilerin DNA’sıyla karşılaştırılabilir. Bu prosedürler, polis soruşturmalarının yürütülme şeklini ve suç-kanıt meselesini gerçekten değiştirdi. Özgünlük testi, örneğin hangi etin türlerden türetildiğini belirlemek için PCR genetik belirteçlerinden de yararlanır. Moleküler arkeoloji de arkeolojik kalıntılardan DNA’yı çoğaltmak için de PCR kullanır.

Çevresel mikrobiyoloji ve gıda güvenliği  – Patojenlerin PCR ile tespiti, sadece hasta numunelerinde değil, aynı zamanda yiyecek veya su gibi matrislerde de bulaşıcı hastalıkların teşhisi ve önlenmesinde hayati olabilir.

PCR, biyomedikal araştırmalardan adli uygulamalara kadar her alanda nükleik asitleri tespit etmek için referans teknolojisidir. Kary Mullis’in yol kenarındaki bir makbuzun arkasına yazdığı fikri devrim niteliğinde bir fikir olarak ortaya çıktı.

Kaynaklar

1. Chien A, Edgar DB, Trela ​​JM. Aşırı termofil Thermus aquaticus’tan deoksiribonükleik asit polimeraz. J Bacteriol 1976; 127 (3): 1550-57 doi: 10.1128 / JB.127.3.1550-1557.1976

2. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, vd. Orak hücre anemisinin teşhisi için beta-globin genomik dizilerinin enzimatik amplifikasyonu ve restriksiyon bölgesi analizi. Science 1985; 230 (4732): 1350 doi: 10.1126 / science.2999980

3. Arya M, Shergill IS, Williamson M, Gommersall L, Arya N, Patel HRH. Gerçek zamanlı kantitatif PCR’nin temel ilkeleri. Molecular Diagnostics 2005; 5 (2): 209-19 doi: 10.1586 / 14737159.5.2.209

4. Bachman J. Bölüm İki – Ters Transkripsiyon PCR (RT-PCR). İçinde: Lorsch J, ed. Enzimolojide Yöntemler: Academic Press, 2013: 67-74. doi: 10.1016 / B978-0-12-420037-1.00002-6

5. Morley AA. Dijital PCR: Kısa bir tarihçe. Biomol Detect Quantif 2014; 1 (1): 1-2 doi: 10.1016 / j.bdq.2014.06.001

6. Taylor SC, Laperriere G, Germain H. Droplet Dijital PCR’ye karşı düşük miktarda hedef içeren gen ekspresyon analizi için qPCR: değişken anlamsızlıktan yayın kalitesi verilerine kadar. Bilimsel Raporlar 2017; 7 (1): 2409 doi: 10.1038 / s41598-017-02217-x

7. Ahrberg CD, Manz A, Chung BG. Mikroakışkan cihazlarda polimeraz zincir reaksiyonu. Lab on a Chip 2016; 16 (20): 3866-84 doi: 10.1039 / C6LC00984K

8. Garibyan L, Avashia N. Polimeraz zincir reaksiyonu. J Invest Dermatol 2013; 133 (3): 1-4 doi: 10.1038 / jid.2013.1

9. VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM. Gen ekspresyon analizi için yirmi beş yıllık kantitatif PCR. BioTechniques 2008; 44 (5): 619-26 doi: 10.2144 / 000112776

Geniş Viral Dünya: Bildiklerimiz (ve Bilmediklerimiz)

 Gönderi tarihi Nisan 25, 2021 Hikmet Geçkil tarafından

Virüslerin küçük ve gizemli dünyasını keşfetmek

Yazı: LAUREN E. OAKES BRYCE, Çizim: GLADFELTER 17 NISAN 2021, NAITULUS

Şekil olarak hafifçe oval ve kenarları biraz bulanık olan siyah lekeler, postmodern bir tabloya çok benzeyen, benekli gri bir arka plana dağılmıştı. 1938’de Berlin Tıp Derneği’nin bir toplantısında, Alman bir doktor ve biyolog olan Helmut Ruska, virüs parçacıklarının şimdiye kadar görülen ilk görüntülerini sunuyordu. Lekeler, poksvirüs ailesinin üyeleriydi, özellikle ektromelia, doğrudan enfekte farelerin lenf sıvılarında görselleştirildi. 

O zamanlar Übermikroscop olarak bilinen elektron mikroskobunun icadı sayesinde , bilim adamları nihayet zaten var olduğu bilinen şeyi gözlemleyebildiler, yani aslında görebildiler: virüslerin küçük ve gizemli dünyası. Ruska’nın bir fizikçi olan kardeşi Ernst, doktorasını tamamlarken enstrümanın ilk prototipini yapmıştı, ancak Helmut cihazın biyoloji alanındaki potansiyel uygulamasını gördü. Helmut ve meslektaşları 1939’un sonunda virüslere ait yaklaşık 2.000 siyah beyaz resim toplamışlardı. Koleksiyonlarında, çiçek hastalığına neden olan variola virüsü ve tütün mozaik virüsü (keşfedilen ilk virüs) de vardı.

Yapısı basit ancak işlevselliği gelişmiş olan virüsler, “cansız ve canlı arasında” yer alan bir kategoride bulunur.

Bilim insanları, 80 yıldan biraz daha uzun bir süre sonra, COVID-19’a neden olan yeni virüs olan SARS-CoV-2’nin ilk görüntülerini yayınladı. İkonik başak (taç) proteinini ortaya çıkarmak için Ruska’nınkine benzer bir alet kullandılar. Siyah beyaz görüntüler, bunun koronavirüs ailesinin bir üyesi olduğunu görsel olarak doğruladı ve dünyanın dört bir yanındaki bilim insanlarının bu tür virüsler hakkında yıllarca önceki araştırmalarından elde edilen mevcut bilgilerden yararlanmaya başlanmasını sağladı. Bilim insanları, bu yeni virüsü, Çin’deki bir grup hastaya Aralık 2019’un sonlarında nedeni bilinmeyen bir pnömoni teşhisi konduktan hemen sonra doğrudan gözlemleyebildiler. Mart 2020’ye gelindiğinde COVID-19, Dünya Sağlık Örgütü tarafından bir salgın ilan edilmişti.

Önceki salgınlarda olaylar çok daha yavaş ilerliyordu.  1300’lerin ortalarında meydana gelen Kara Ölüm (vaba) salgını, dört yıl içinde Avrupa nüfusunun üçte birinden fazlasını, kimse buna neyin sebep olduğunu bilmeden öldürdü. 1918 grip salgınında, bilim adamları hastalığın nedeninin biliyordu ancak bunun için virüs görecek araçlar veya onu test edecek PCR gibi testler yoktu. SARS-CoV-2 ortaya çıktığında, onlarca yıl önce yürütülen temel bilim araştırmalarının değeri, virüs tespiti için yenilikçi araçlar biçiminde hızla ortaya çıktı. Araştırmacılar artık yeni virüslerin genomlarını dizileyebilie ve genomlarını inceleyebiliyordu. Ancak bugün bile gelişmiş genomik teknolajilere rağmen bile elektron mikroskobu bu tür patojenlerin benzersiz bir “açık” görünümünü sunmaya devam ediyor.

ABD Hastalık Kontrol Merkezleri (CDC) için patojenleri belirlemek için elektron mikroskobu kullanan Cynthia Goldsmith, “Bir resimle gerçekten tartışamazsınız” diyor. “Bu teknoloji, yalnızca virüsün nasıl göründüğünü değil, aynı zamanda hücrede nasıl büyüdüğünü de görmemizi sağlıyor.” Goldsmith yıllar içinde sayısını tahmin bile edemeyeceği kadar çok virüs tespit etmiş olsa da, incelediği virüsler zaten hastalığa neden olduğu bilinenlerle ve esas olarak insanları enfekte edenlerle sınırlı. Ancak bilim adamları  , memeli ve kuş ev sahiplerinde 1.67 milyon henüz keşfedilmemiş viral türün var olduğunu tahmin ediyor  . Örneğin yarasalar,  yeni  koronavirüs türleriyle doludur . Evrendeki yıldızlardan daha fazla virüs olabilir . Bugün yürütülen temel bilim araştırmaları, onların geçmişini, bugününü ve geleceğini anlamamıza ve bizi daha da yeni virüslerin ortaya çıkmasına daha iyi hazırlamamıza yardım etmede kritik bir rol oynayacaktır.

Stanford Üniversitesi’nden Laura Bloomfield, “Bilim adamları ve halk sağlığı yetkilileri, bir sonraki salgının ne zaman ve nerede ortaya çıkacağını düşünmek için çok zaman harcadılar” diyor. “Ama öğrendiğimiz şey, bunu kesin olarak tahmin etme olasılığının çok düşük olduğu. Hazırlık ve müdahale etmek için yapıları yerli yerince yerlerine koymamız ve aynı zamanda gelecekteki salgınları en başta önlememiz gerekiyor. ” 

Bu, temel bilim araştırmalarına girmek anlamına gelecektir. Bu, yalnızca daha fazla virüs keşfetmek ve dizilemek anlamına gelmeyecek, aynı zamanda virüslerin yapılarını anlama yeteneğimizi, konakçılarıyla nasıl etkileşime girdiklerini ve tarih boyunca nasıl evrimleştiklerini daha iyi hale getirecek araştırmalara yatırım yapmak anlamına gelecektir. Ek olarak, bir sonraki salgına hazırlanmak aynı zamanda insan davranışına daha fazla odaklanmak ve doğa ile olan ilişkimizi onarmak anlamına gelecektir. Yerel ormanların, endüstriyel ormancılık veya tarım için tahrip edilmesi, insan yerleşimlerinin veya arazi kullanımının el değmemiş ve bozulmamış ekosistemlere genişletilmesi ve vahşi yaşamın ticareti gibi faaliyetler, başka bir felaket salgını olasılığını büyük ölçüde artırır.

Virüslerin keşfi

Ruska’nın zamanında araştırmacılar, virüsleri belirleyip tanımlamak için “filtrelenebilir bulaşıcı ajanlar” terimini kullandılar. Deney, çıplak gözle görülemeyen bu küçük varlıkların, bakterileri ve diğer mikroorganizmaları yakalayan ve tutan filtrelerden geçebildiğini ortaya çıkardı. Latince bir kelime olan “yapışkan sıvı“, “güçlü meyve suyu” veya “zehir” anlamına gelen “virüs” terimi, hem filtrelerden geçebilecek kadar küçük hem de canlı bir konakçı olan bitkinin veya hayvanın yardımı olmadan üreyemeyen ajanlar için kullanılmıştır. Hollandalı bir mikrobiyolog ve botanikçi olan Martinus Beijerinck,  19. yüzyılda hastalıklı tütün bitkisi yapraklarından elde edilen öz (ekstrakt) ile deneyler yaparak virüslerin hastalığa neden olduğunu gösterdi.

Beijerinck, ışık mikroskobu ile tespit edilemeyecek kadar küçük bir varlığın bitkileri enfekte edebildiğini gösteren ilk bilim insanlarından biriydi. Beijerinck’in hasta bitkilerden taze ekstrakte edilmiş özsu uygulaması, sağlıklı bitkilerin yapraklarında lekeler oluşturdu; ne kadar çok özsuyu uygularsa, semptomlar o kadar kötüydü. Hasta bitkilerden elde edilen özsuyu  contagium vivum Fluidum  (bulaşıcı canlı sıvı) olarak adlandırdı. Bunun, “bölünen ve büyüyen hücrelerin içine girdiğini”, yani çoğalmak için başka canlıların (bu durumda bitki hücrelerinin) gerekli olduğu anlamına geldiğini belirtti.

Beijerinck’in diğer bitkileri enfekte edebilen bu “sıvı zehri” keşfetmesi, bugün yeni virüsleri belirleme, tanımlama, morfolojilerini (yapılarını) deşifre etme ve bu bilgileri, virüslerin neden oldukları hastalıklara karşı tedaviler geliştirmek için kullanma yeteneğimizin temelini oluşturdu. Ama aynı zamanda popüler virüs algımızı sadece patojenik, yani hastalığa neden olabilecek şekilde önyargılı hale getirdi. Çoğu durumda, virüsler hastalığa neden olmaz ve hatta birçoğu yararlıdır. Bazı virüsler sağlık için tehdit oluştururken, diğerleri yararlı işlevler yerine getirerek hayatımızı daha iyi ya da daha kötü şekilde şekillendirirler.

Virüsler hayatı nasıl şekillendirir?

Yapısı basit, ancak işlevselliği gelişmiş olan virüsler, “cansız ve canlılar arasında yer alan” bir kategoride bulunur. Bazı biyologlar onları yarı canlı olarak düşünürken, diğerleri onlardan cansız küçük parçacıklar (partiküller) veya madde düzenlemeleri (montajı) olarak bahsediyor. Ancak uzmanlar, bunların hayat ağacını saran sarmaşıklar gibi oldukları konusunda hemfikir; Varoluşları, iki yaşam biçimi arasında yakın bir ilişki olan simbiyozu içerir. Virüsler yalnızca canlı hücrelerin içinde çoğalabilir. En sağlıklı halimizde bile, vücudumuz trilyonlarca virüse, belki daha fazlasına ev sahipliği yapar. Orada “canlı” gibidirler. Çünkü genetik materyalleri konakçılarının hücrelerine nüfuz edip onları virüs üreten fabrikalara dönüştürür. 

Wildlife Conservation Society’nin Sağlık Programı’ndan hastalık ekolojisti Sarah Olson, “Bir virüs ve bir hücreyi birlikte mikroskobik bir kopya makinesi olarak düşünün” diyor. “Virüs, hücreye girmek için mevcut giriş noktalarını kullanıyor – ve girdiğinde, hücrenin mekanizmasını ele geçirmek ve kendisinin kopyalarını yapmak için talimatlar taşıyor. Sonra bir sonraki makineye (hücreye) gider. “

“Viruslar”, hücrelerin çok eski zamanlardan gelen torunları olabilir, ancak bazı araştırmacılar onların yaşamın dördüncü bir boyutunu oluşturabileceklerini öne sürüyor.

Bir virüs, bir dizi adımda çoğalır: önce bir konakçı hücreye bağlanır ve kendi genetik materyalini (DNA veya RNA) enjekte eder, ardından hücre daha fazla virüs ürettikçe kendisini hücrenin genetik materyaline dahil eder. Viral bilgi bir konakçının genomuna entegre edildiğinde, bu bilgi konağın bir parçası haline gelir ve nesiller boyunca aktarılabilir. Aslında, insan genomunun yaklaşık yüzde 8’i viral genlerden geliyor, bu da virüslerle birlikte evrimleştiğimiz ve bunu yapmaya devam edeceğimiz anlamına geliyor. Ayrıca, virüsler olmadan, insanlar ve diğer memeliler “doğurma” yerine hala “yumurta bırakıyor” olabilirdi. Evrim sırasında bir noktada, plasenta oluşumu için gerekli olan protein sintin,  bir retrovirüs enfeksiyonundan geldi. Ayrıca virüslerin, bakterilerin bağırsaklarımızı işgal etmesini önleyebileceğini de biliyoruz.  

Diğer canlılar gibi virüsler de Darwinci bir misyonu yerine getiriyorlar: sayılarını olabildiğince artırmayı, coğrafi sınırlarını genişletmeyi ve zaman içinde hayatta kalmayı hedefliyorlar. Aşılar piyasaya sürülürken ve yeni varyantlar tanımlanırken bile, SARS-CoV-2’nin şu anda yaptığı tam olarak budur. Ancak geçmiş hala önemlidir. Seattle’daki Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi’nde biyolog olan Michael Emerman’ın söylediği gibi, virüslerin evrimsel tarihindeki eski olayları incelemenin motivasyonu, acil modern zorlukları daha iyi anlamaktır. 

Virüslerin kökenleri ve tarihsel geçmişleri neden önemli

Virüslerin kökenleri ve evrimleri üzerine yapılan temel araştırmalardan ortaya çıkan modeller, gelecekteki pandemilere hazırlıklı olma durumumuzu bilgilendirmeye yardımcı olabilir. Viral evrim hakkında yazılar yazan biyolog Julia Durzyńska (Polonya, Poznań’daki Adam Mickiewicz Üniversitesi), “Mevcut tüm virüslerin kökenleri hakkında tek bir açıklamaya sahip olmak istersiniz” diyor. “Bunun yerine, birbirini tamamlayan üç baskın model var.” 

Sözde “virüsler ilktir” modeli, yaşamın başlangıcında, hücrelerden önce çok basit virüs formlarının var olduğunu öne sürüyor. Modern virüslerin eski ataları, hücresel yaşamın gelişimi için hammadde sağlamış olabilir. Bu model bugün dünyadaki tüm virüsler için geçerli olsaydı, hepsinin birkaç viral atadan evrimleştiği anlamına gelirdi. Bazı açılardan bu, yeni virüslerin tanımlanmasını ve aşıların veya tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırırdı: bilim adamları, bir virüs hakkında bildiklerini alıp, akrabalarını anlamak için bunu başlangıç ​​noktası olarak kullanabilirdi. 

Viral kökenlerin ikinci model “kaçış” veya “ilerleyen modeli“, virüslerin daha büyük organizmaların genlerinden kaçan genetik unsurlardan kaynaklandığını öne sürer. Örneğin bakteriyofajlar (bakterileri enfekte eden virüsler), bakteriyel genetik materyal parçalarından gelir. Dolayısıyla bu modele göre, tüm virüsler çok hücreli yaşamın varolmasından önce, çok eski zamanlardan gelmiyor.

“İndirgeme” modeli olarak bilinen üçüncü model, virüslerin bir zamanlar daha büyük, serbest yaşayan organizmalar olduğu hipotezine dayanmaktadır. Zamanla genetik bilgilerini kaybettiklerine ve sonunda küçüldüklerine ve tek başına üreyemediklerine inanılıyor. Ancak diğer organizmaların hücrelerinde çoğalarak varlıklarını sürdürmeyi başardılar. Bu modelin en yaygın şekilde kanıtı olarak yorumlanan keşif, ilk olarak 2003 yılında izole edilen ilk “dev virüs” olan mimivirüstür.

Dev virüsler viral dünyaya bakışımızı nasıl genişletti?

Yirmi beş yıl önce, şu anda Davidson Koleji’nde biyolog olan David Wessner, koronavirüsler üzerine çalışan bir araştırma ekibinde doktora sonrası bir akademisyendi. Çalışması, virüslerin dışından çıkıntı yapan sivri uçlu (taç, Spike) proteinleri incelemeyi ve hücrelerle nasıl etkileşime girdiklerini belirlemeyi içeriyordu. Wessner, “Bu temel araştırmaların çoğu, COVID-19 ortaya çıktığında tepki vermeye zemin hazırladı,” diyor ve aynı şey dev virüsler üzerine yapılan temel araştırmalar için de geçerli olabilir. Henüz insan sağlığını önemli ölçüde etkileyen dev bir virüs tanımlamadık, ancak bu değişebilir. “

Daha sonra mimivirüs olarak adlandırılacak olan şey ilk olarak İngiltere’de 1992 pnömoni salgınının araştırılması sırasında gözlemlendi. Fransa’daki Aix-Marseille Université’de bir mikrobiyolog olan Bernard La Scola, bilinmeyen varlığı izole etmek ve yapısını incelemek için çok yıllık bir çabaya öncülük etti. O sırada elektron mikroskobu ile çalışan bir arkadaşı vardı. La Scola, “Ona bir örnek verdim” diyor. “Ona bu ilginç konuya bakıp bakamayacağını sordum ve ne olduğu hakkında hiçbir fikrim olmadığını söyledim.”

La Scola, ortaya çıkan görüntüyü ilk gördüğünde dev bir virüsü düşünmediğini söylüyor.

“Ölçeğe baktıktan sonra virüs olamayacak kadar büyük olduğunu fark ettim. Ve biz de bununla çalışmaya başladık. ” La Scola ve meslektaşları, yeni bir şeyi izole ettiklerini biliyorlardı.

Virüsler, sayılarını olabildiğince artırmayı, coğrafi sınırlarını genişletmeyi ve zaman içinde hayatta kalmayı hedefler.

Nihayetinde, mimivirüsün ( Acanthamoeba polyphaga ) ve daha sonra mamavirüsün ve daha sonra daha  da büyük pandoravirüsün keşfi, göreceli boyutları ve genetik karmaşıklıkları göz önüne alındığında, bir virüs olmanın ne anlama geldiğine dair insan algısını değiştirdi. Bazı bilim insanları, “bunların” derin eski zamanlardan gelen hücrelerin torunları olabileceğini düşünürken, diğerleri, yaşam ağacı modelini oluşturan arkeler, bakteriler ve ökaryot domeynlerinden farklı olarak, yaşamın dördüncü bir boyutunu oluşturabileceklerini öne sürüyorlar. 

La Scola, virüslerin kökeni ile ilgili tartışmalara pek girmez; bunun yerine yeni virüsleri izole etmeye ve tanımlamaya odaklanır. Yıllar boyunca, kendisi ve öğrencileri, üniversitesi, Méditerranée Enfeksiyon Vakfı ve Fransa Sağlık Bakanlığı dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan fon aldılar, ancak La Scola, dev virüsler üzerindeki çalışmalarının çoğunun fonlanmadığını söylüyor. Diğer, daha uygulamalı projeler için aldığı fondan ve kendisinin ve diğerlerinin yoğun ilgisinden ve ısrarından yararlandı.

Bugün, dev virüslerin insan sağlığını dramatik bir şekilde etkilediği bilinmese de, La Scola temkinli bir şekilde Afrika domuz ateşi virüsü Asfivirus’a işaret ediyor. Kenelerden domuzlara ve domuzlar arasında geçiş yapar. Kanamalı ateşe neden olur ve La Scola ve ekibinin Marsilya’da kanalizasyondan izole ettiği dev bir virüsle yakından ilgilidir. 

“Bu bir genom indirgeme örneği, çünkü genomunun yaklaşık üçte ikisini kaybetti” diyor. “Ve şimdi bu dev virüs muhtemelen omurgalılarda, yani domuzlarda hemorajik ateşin etkeni.” Virüs daha büyük bir organizmadan gelmiş ve hastalığa neden olacak şekilde evrimleşmiş olabilir. Bir kez oldu, bu yüzden tekrar olabilir ve belki de insanlarda. 

2020’de La Scola ve meslektaşları, başka bir yeni virüs olan Yaravirüs‘ün şaşırtıcı kökenleri üzerine bir makale yayınladılar. Virüsü genetik bilgisini deşifre etmek için dizilediklerinde, bazı genlerin dev virüslerde bulunanlara benzer göründüğünü fark ettiler, ancak Yaravirüs’ün onlarla nasıl ilişkili olup olmadığını çözemediler. Genlerinden hiçbiri, bilinen organizmaların herhangi bir dizisiyle eşleşmedi. Tamamen yeniydi. Yani benzersiz genetik bilgilerle karakterize edilen bir karanlık madde virüsü idi. Böylesine karanlık bir madde, uçsuz bucaksız bir uçurum, daha iyi anlamamız gereken viral bir dünyanın kanıtıdır.

İnsan davranışının rolü 

Sağlıklı ormanlar gibi bozulmamış ekosistemlerde, virüsler ve vahşi konakçıları uzun zamandır birbirleriyle hassas bir denge içinde etkileşime girmişlerdir. İnsanlar bilim insanlarının”mevcut hastalık ekolojisi ağı” dedikleri şeye müdahale ettiklerinde, kendilerini genellikle yabancı virüslere maruz bırakırlar. Benzer şekilde, vahşi hayvanları ormandan alıp ticari pazarlara taşımak da insanları yeni virüslere maruz bırakır. İleriye bakıldığında, insanların viral dünyayla gezinmeleri kısmen “uçta”, yani insanların ve vahşi yaşamın etkileşime girdiği ve patojenlerin değiş-tokuş edildiği bozulmuş habitatlar tarafından şekillendirilecektir.

Bloomfield, “Bununla ilgili bir ölçü var: kenar yoğunluğu” diyor. Kenar yoğunluğu, insanların günlük faaliyetlerini gerçekleştirdiği bir arazideki parçalanmanın şeklini ve kapsamını ifade eder. Ağaç kesmek, yollar inşa etmek ve kentsel yerleşimlerin genişletilmesi bu tür parçalanmaya neden olabilecek faaliyetlerdir.

Çevresel bozulma, insanlar ve hayvan habitatları arasında daha fazla “kenar” ve dolayısıyla insanların daha önce maruz kalmadıkları virüslerle daha fazla temas etme olasılıkları yaratır. Bloomfield, peyzajları değiştirmenin insanlar ve vahşi yaşam arasındaki etkileşimi nasıl teşvik ettiğini ve bulaşıcı hastalıkların ortaya çıkışını nasıl etkilediğini araştırıyor. Bulaşıcı hastalık uzmanları genellikle belirli hastalıklara odaklanırken, halk sağlığı uzmanları genellikle virüsün yarasa veya maymundan insana geçişi (zoonotik) gibi bir türden diğerine geçtiği yayılma olaylarının ayrıntılarını araştırır. Ancak Bloomfield, çok daha büyük modellerle ilgileniyor: insan davranışının çevresel bozulmayı nasıl yönlendirdiği, sınır yoğunluğunu ve dolayısıyla hastalık bulaşma riskini nasıl artırdığı.

Amazon ormanına açılan yolların balık kılçığı deseni yaygın bir örnektir. 2000 ve 2001’de Peru’daki araştırmacılar, ormansız bölgelerde sivrisinekler tarafından nispeten bozulmamış alanlara kıyasla 278 kat daha yüksek ısırma oranını belgelediler.  Yeni güneşli havuzlarda sivrisinekler hızla çoğaldıkça ve insanlar ormana girdikçe sıtma vakaları arttı. Uganda’da Bloomfield’ın araştırması, hane halkları ve ev yapımı için malzeme toplama gibi faaliyetler etrafında daha fazla kenar yoğunluğu olduğunu ortaya koydu. Ormanlık habitatlarda yiyecek arama, insanlarla diğer primatlar arasındaki temas olasılığını da artırır. Araştırmacılar, orman bozulmasının Nipah, Hendra ve Ebola gibi vahşi yaşamdan kaynaklanan birçok virüsün salgınlarıyla ilişkili olduğunu bulmuşlardır. 

Bloomfield, “Biyolojik çeşitliliğin daha yüksek olduğu alanlar ve bu biyolojik çeşitliliğe insan müdahalesi kesinlikle endişe verici konulardır” diyor. “Türler arasında ne kadar çok etkileşim olursa, nadir bulaşma olayları için o kadar yüksek olasılık var” diye belirtiyor. Yeni hastalıkların ortaya çıkışıyla ilgili ileri görüşlü bir kitap yazan bilim muhabiri David Quammen, fenomenin bir çift zar atma ve yılan gözü alma şansına benzediğini açıklıyor. Bir zar atma olasılıkları düşüktür, ancak zarları yeterince sık atarsanız, sonunda bir çift ile sonuçlanırsınız. Doğru virüs insanlara doğru koşullar altında bulaştığında yayılmalar ve salgınlar meydana gelebilir. Modern seyahat ve dünya genelindeki mevcut insan bağlantı düzeyimiz, enfekte bir kişi bir yerden diğerine seyahat ettiğinde bir salgının hızla salgın haline gelebileceği anlamına geliyor.

Belki de doğru dengeyi ancak viral dünyayı ve virüslerin hayatlarımızı şekillendirmeye devam ettiği birçok yolu daha iyi anlayarak, bize saldırıp, bir parçamız haline gelerek ve bize yardım ederek bulabiliriz. Bozulmayı ve vahşi yaşam ticaretini durdurmak, insanları yeni ve potansiyel olarak zararlı virüslerden ayrı tutmamıza da yardımcı olacaktır.

2015’ten önce, ortaya çıkan bulaşıcı hastalıklarla ilgili veriler, ihmal edilen hastalıklarla ilgili araştırma ve geliştirme için küresel finansmanı izleyen ve raporlayan bir proje olan G-FINDER tarafından takip edilmiyordu (küresel düşünce kuruluşu Policy Cures Research’ün himayesinde ve Bill ve Melinda Gates Vakfı). Ebola salgınının bir kombinasyonu; SARS, MERS ve H1N1 gibi pandemiler; ve küresel sağlık güvenliğine ilişkin artan endişe, sorunu SARS-CoV-2’nin ortaya çıkmasından önce bile kolektif bilinçte gündeme getirdi. Yine de, virüsler ve ortaya çıkan bulaşıcı hastalıklarla ilgili temel bilim araştırmalarına yönelik finansman, birçok uzmanın olması gerektiğini düşündüğü yerde değil. 

İnsanlar, hayvanlar, bitkiler ve onların paylaşılan çevreleri arasındaki karşılıklı bağlantıların giderek daha fazla tanınması  (ve bu bağlantıların insan sağlığı üzerindeki etkileri) daha disiplinler arası araştırma ve işbirliğine doğru bir paradigma değişimini de gerektirecektir. İnsanların, hayvanların ve çevrenin sağlığı derinlemesine iç içe olduğu için, araştırma çabaları ve problem çözme tıp ve çevre bilimcilerinin çabaları arasında köprüler kurulmasını gerektirir. Şimdiye kadar, bu tür disiplinler arası araştırmayı teşvik eden pek çok mekanizma yok. Bloomfield, “Bence vakıflar muhtemelen bu desteğin çoğunu bulacağımız yer” diyor.

Dünyanın dört bir yanındaki bilim insanları, yeni koronavirüsün ilk görüntülerinin elde edilmesinden bir yıldan kısa bir süre sonra COVID-19’a karşı etkili bir aşı geliştirerek bu yıl tarih yazdı. Böylesine benzeri görülmemiş bir tepkinin temelini oluşturan temel bilim araştırmasıydı; geçmişte aşıların geliştirilmesi genellikle 10 ila 15 yıl sürmüştür. Kısmen doğayla ve birbirimizle devam eden etkileşimlerimizle şekillenen geleceğimiz, bu yaklaşımın sürdürülmesini gerektiriyor: mevcut bilgiyi eyleme geçirmek ve hala tam olarak bilmediğimiz viral bir dünyayı deşifre etmeyi amaçlayan temel araştırmaları desteklemek.

Lauren E. Oakes, Yaban Hayatı Koruma Derneği’nde koruma bilimcisi, Stanford Üniversitesi Yer Sistemi Bilimi Bölümü’nde yardımcı profesör ve bilim yazarıdır. Kanarya Ağacı Arayışında (Temel Kitaplar, 2018) yazarıdır .

Bu makale ilk olarak   Science Philosophy Alliance Channel’da  Nisan 2021’de yayınlandı.